【AbMole】单细胞凝胶电泳实验详细指南

实验原理：

1. DNA损伤检测：细胞DNA链断裂时，超螺旋结构受损，在碱性条件下解螺旋，损伤片段在电泳中向阳极移动形成彗星状拖尾。
2. 荧光观察：未损伤DNA保持原位，染色后成圆形荧光团，便于观察损伤情况。

实验用途：

DNA损伤评估：用于评价单个细胞的DNA损伤，适用于生物反应研究和肿瘤治疗预测。

材料与仪器：

1. 试剂：低熔点琼脂糖、正常熔点琼脂糖、PBS、TBE、溴化乙锭（EB）、Tris-HCl溶液、RIPA细胞裂解液等。
2. 设备：荧光显微镜、核酸电泳仪、载玻片、盖玻片等。

实验步骤：

1. 细胞准备：

   1. 使用胰酶将细胞从培养皿或培养瓶中消化下来，确保消化过程充分，避免细胞过度消化或消化不足。
   2. 将消化后的细胞收集到离心管中，并进行细胞计数，以调整细胞密度至10^5~10^6个/ml。这通常通过加入适量的PBS缓冲液来实现。

2. 第一层凝胶制备：

   1. 取80 μl的0.5%正常熔点琼脂糖溶液，滴加到预热至适宜温度的载玻片上。注意温度控制，避免琼脂糖过快凝固。
   2. 迅速盖上干净的盖玻片，确保没有气泡产生，然后将载玻片放置在4℃环境中静置10分钟，使琼脂糖完全凝固。

3. 第二层凝胶（含细胞）制备：

   1. 取10 μl含有约10000个细胞的PBS溶液，与75 μl的0.5%低熔点琼脂糖溶液在37℃条件下混合均匀。注意混合时要轻柔，避免产生气泡。
   2. 轻轻揭去第一层凝胶上的盖玻片，将含细胞的低熔点琼脂糖混合液滴加到第一层凝胶上，并立即盖上新的干净盖玻片。
   3. 将载玻片再次放置在4℃环境中静置10分钟，使第二层凝胶完全凝固。

4. 第三层凝胶制备：

   1. 第三层凝胶的制备方法与第一层相同，即取80 μl的0.5%正常熔点琼脂糖溶液滴加到第二层凝胶上，盖上盖玻片，并在4℃环境中静置10分钟使其凝固。

5. 细胞裂解：

   1. 移去第三层凝胶上的盖玻片，将载玻片小心浸入新配置的RIPA细胞裂解液中。确保裂解液能够完全覆盖凝胶表面。
   2. 将载玻片在裂解液中至少放置2.5小时，以充分裂解细胞膜及核膜，去除蛋白质、RNA等杂质，仅保留核骨架。裂解时间应尽量保持一致，以确保实验结果的准确性。

6. 电泳前处理：

   1. 细胞裂解完成后，取出载玻片，用PBS缓冲液轻轻冲洗2次，以去除残留的裂解液和其他杂质。
   2. 将载玻片置于水平电泳槽中，倒入适量的1X TBE电泳缓冲液，确保缓冲液覆盖胶面约0.25 cm。

7. 电泳：

   1. 在电泳槽中进行碱解旋处理，通常持续20分钟。这一步骤有助于进一步打开DNA的双螺旋结构，使损伤片段更容易在电泳中迁移。
   2. 将电泳槽置于4℃冰箱中，设置电压为25 V，进行电泳25~30分钟。电泳过程中需保持电压稳定，避免产生过大的电流或热量对实验结果造成影响。

8. 中和与染色：

   1. 电泳结束后，取出载玻片，用滤纸轻轻吸干电泳缓冲液。
   2. 将载玻片置于Tris-HCl（pH 7.5）溶液中中和15分钟，以去除残留的碱性物质。
   3. 每片载玻片上滴加50 μl的30 μg/mL溴化乙锭（EB）溶液进行染色。注意EB是剧毒物质，操作时需做好防护措施。染色过程应在避光条件下进行，以防止荧光淬灭。
   4. 盖上盖玻片后，继续在避光条件下染色20分钟。

9. 观察与记录：

   1. 染色完成后，尽快在荧光显微镜下观察电泳图谱。未损伤的DNA部分将呈现为圆形荧光团，而损伤的DNA片段则形成彗星状的拖尾图像。
   2. 使用显微镜的拍照功能记录实验结果，以便后续分析和比较。

注意事项：

1. 细胞消化：确保细胞消化彻底，避免粘连。
2. 凝胶制备：制胶过程需细致，避免气泡，保持胶面平整。
3. 裂解处理：裂解液需澄清且完全溶解，裂解不彻底需延长裂解时间或换用强裂解液。
4. 剧毒物质：溴化乙锭是剧毒物质，需做好防护，可考虑替代染料。

常见问题及解答：

1. 细胞粘连：细胞消化过程在孵箱中进行，轻轻吹吸。
2. 尾巴扭曲：制胶和剥胶过程小心，电泳保持低电压且平稳。