第五章 RNA-seq分析

第五章 RNA-seq分析

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主要为RNA-seq相关知识，部分内容作笔记自查使用。如有错误或遗漏还请海涵，可评论或邮箱联系。
最后修改时间：2020-09-01 16:11:38 星期二

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转录组研究方法

• 定性
  鉴定出所有表达的转录本
• 定量
  确定转录本各自的表达量

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RNA-seq可以做什么

• Level 1:
  • 每个基因的表达量是多少
• Level 2:
  • 有哪些转录本？
  • 有哪些可变剪切？
  • 是否会有一种方式的可变剪切产生的前体mRNA(isoform)，较为富集
  • 不同样本之间是否有表达量差异

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RNA-seq之前的技术

Real-Time qRT-PCR(实时荧光定量PCR)

转录本定量测量金标准，准确率极高，类似于DNA的一代测序

通过对经典PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，可以实现对起始模板的定量分析。可以在很大范围内定量的检测目标转录本的拷贝数，即表达水平。

• 优点：非常准确
• 缺点：通量低，一次只能测定1个转录本的表达水平；须事先知道待检测转录本的序列，不能用来发现未知转录本和基因

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RNA-seq测序过程

1. 将样本中RNA反转录为cDNA
2. 将cDNA打碎为较小片段后上机测序

RNA-seq本质上是对转录本序列的随机抽样，因此其检测效力(power)和灵敏度(sensitivity)高度依赖于测序的深度。测序深度不够，就难以检出低拷贝的基因。哺乳动物转录组，经验规则是100~150x的coverage

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RNA-seq mapping过程

1. 向已知转录本上回贴
2. 向参考基因组上回贴

在DNA转录成mRNA的过程中，内含子会被切掉，外显子会在剪切位点连接到一起。跨过剪切位点的reads称为junction reads。当回贴到基因组上时，junction reads是无法直接回贴的，需要准确的在剪切位点将其断开。

junction reads是一种可变剪切存在(如存在exon1和exon3直接相连)的直接证据，非常重要。

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回贴junction reads的策略

策略1. join exon

1. 基于已知转录本中所有exon，两两组合，构建所有可能的junctions的library。这个junction未必是已知的，而是所有可能的组合
2. 首先采用和DNA reads类似的unspliced方式和参考基因组比对，将非junction reads回贴到基因组上
3. 对于无法直接回帖的junction reads，拿来与第一步中构建的junction library进行比对

相当于DNA mapping算法在RNA-seq技术上的一个补丁。但对于以前未知的exon，该策略无能为力

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策略2. split reads

1. 首先采用和DNA reads类似的unspliced方式和参考基因组比对，将非junction reads回贴到基因组上
2. 对于无法直接回帖的junction reads，参照BLAST的方法，将其切分成若干长度为k的seed，再使用这些seed来回贴，在更小的粒度上寻找junction site
3. 将临近的已回贴seeds重新组合起来，得到全read的比对结果

速度比策略1慢，但不依赖于先验exon注释，因此可以发现新的exon乃至新的基因

现有工具一般会组合2个策略。先采用join exon策略快速检测已知的junction site，再利用split reads策略发现新的junction site

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RNA-seq转录本组装

在mapping结束后，需要将reads重新组装成转录本。下文简述Cufflinks软件的组装算法

左上图上部，每一条带颜色的线段代表一个read。首先Cufflinks会去找不可能出现在同一个转录本中的reads，如左上图中红圈圈出的黄色和蓝色两条reads。可以出现在同一转录本中的reads，彼此相容，在左上图中涂上了同一种颜色

通过将每个相容read作为节点，并与和它最近且相容的节点连接，就可以得到重叠图(Overlap graph)。基于精简原则(parsimony principle)，Cufflinks在图中选择能覆盖所有reads的路径中互不相连且最少的一组路径，作为最优路径。据此来得到最终的三个转录本集合

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表达量计算

1. 因为RNA-seq是随机抽样，因此map到特定转录本上的reads数目正比于表达量
2. map到特定转录本上reads的数目，也正比于该转录本的长度和总测序深度
   
   A转录本长度是B转录本的2倍，表达量相同时，map到A转录本上的reads数量应该是B的2倍
   
   实验1的测序深度是实验2的2倍，因此相同转录本在实验1被map的reads数量应该是实验2的2倍

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将reads计数归一化为表达量

C：map到该转录本上reads的总数
N：map成功的reads总数
L：该转录本的长度

通过考虑不同的误差因素，引入不同的生物学假设，可以构造不同的归一化方法。后续提出了效果更好的归一化方法TMM、DESeq等

事实上，为了更为准确的估计表达量，常采用EM等方法来反复迭代的考虑转录本组装与表达量估计