第五章 RNA-seq分析

最新推荐文章于 2024-09-11 07:29:27 发布
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分类专栏： RNA-seq
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第五章 RNA-seq分析

主要为RNA-seq相关知识，部分内容作笔记自查使用。如有错误或遗漏还请海涵，可评论或邮箱联系。
最后修改时间：2020-09-01 16:11:38 星期二

转录组研究方法

  • 定性
    鉴定出所有表达的转录本
  • 定量
    确定转录本各自的表达量

RNA-seq可以做什么

  • Level 1:
    • 每个基因的表达量是多少
  • Level 2:
    • 有哪些转录本？
    • 有哪些可变剪切？
    • 是否会有一种方式的可变剪切产生的前体mRNA(isoform)，较为富集
    • 不同样本之间是否有表达量差异

RNA-seq之前的技术

Real-Time qRT-PCR(实时荧光定量PCR)

转录本定量测量金标准，准确率极高，类似于DNA的一代测序

通过对经典PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，可以实现对起始模板的定量分析。可以在很大范围内定量的检测目标转录本的拷贝数，即表达水平。

  • 优点：非常准确
  • 缺点：通量低，一次只能测定1个转录本的表达水平；须事先知道待检测转录本的序列，不能用来发现未知转录本和基因

RNA-seq测序过程

  1. 将样本中RNA反转录为cDNA
  2. 将cDNA打碎为较小片段后上机测序

RNA-seq本质上是对转录本序列的随机抽样，因此其检测效力(power)和灵敏度(sensitivity)高度依赖于测序的深度。测序深度不够，就难以检出低拷贝的基因。哺乳动物转录组，经验规则是100~150x的coverage

RNA-seq mapping过程

  1. 向已知转录本上回贴
  2. 向参考基因组上回贴

在DNA转录成mRNA的过程中，内含子会被切掉，外显子会在剪切位点连接到一起。跨过剪切位点的reads称为junction reads。当回贴到基因组上时，junction reads是无法直接回贴的，需要准确的在剪切位点将其断开。

junction reads是一种可变剪切存在(如存在exon1和exon3直接相连)的直接证据，非常重要。

回贴junction reads的策略

策略1. join exon

  1. 基于已知转录本中所有exon，两两组合，构建所有可能的junctions的library。这个junction未必是已知的，而是所有可能的组合
  2. 首先采用和DNA reads类似的unspliced方式和参考基因组比对，将非junction reads回贴到基因组上
  3. 对于无法直接回帖的junction reads，拿来与第一步中构建的junction library进行比对

相当于DNA mapping算法在RNA-seq技术上的一个补丁。但对于以前未知的exon，该策略无能为力

策略2. split reads

  1. 首先采用和DNA reads类似的unspliced方式和参考基因组比对，将非junction reads回贴到基因组上
  2. 对于无法直接回帖的junction reads，参照BLAST的方法，将其切分成若干长度为k的seed，再使用这些seed来回贴，在更小的粒度上寻找junction site
  3. 将临近的已回贴seeds重新组合起来，得到全read的比对结果

速度比策略1慢，但不依赖于先验exon注释，因此可以发现新的exon乃至新的基因

现有工具一般会组合2个策略。先采用join exon策略快速检测已知的junction site，再利用split reads策略发现新的junction site

RNA-seq转录本组装

在mapping结束后，需要将reads重新组装成转录本。下文简述Cufflinks软件的组装算法

左上图上部，每一条带颜色的线段代表一个read。首先Cufflinks会去找不可能出现在同一个转录本中的reads，如左上图中红圈圈出的黄色和蓝色两条reads。可以出现在同一转录本中的reads，彼此相容，在左上图中涂上了同一种颜色

通过将每个相容read作为节点，并与和它最近且相容的节点连接，就可以得到重叠图(Overlap graph)。基于精简原则(parsimony principle)，Cufflinks在图中选择能覆盖所有reads的路径中互不相连且最少的一组路径，作为最优路径。据此来得到最终的三个转录本集合

表达量计算

  1. 因为RNA-seq是随机抽样，因此map到特定转录本上的reads数目正比于表达量
  2. map到特定转录本上reads的数目，也正比于该转录本的长度和总测序深度

    A转录本长度是B转录本的2倍，表达量相同时，map到A转录本上的reads数量应该是B的2倍

    实验1的测序深度是实验2的2倍，因此相同转录本在实验1被map的reads数量应该是实验2的2倍

将reads计数归一化为表达量


C：map到该转录本上reads的总数
N：map成功的reads总数
L：该转录本的长度

通过考虑不同的误差因素，引入不同的生物学假设，可以构造不同的归一化方法。后续提出了效果更好的归一化方法TMM、DESeq等

事实上，为了更为准确的估计表达量，常采用EM等方法来反复迭代的考虑转录本组装与表达量估计

wangchuang2017
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RNA-seq分析：Step1（软件的安装及配置）
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基于单细胞RNA-seq和大量RNA-seq数据的CAF风险特征构建成纤维细胞特征风险模型
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`powsimR`：单细胞与批量RNA-seq实验的强大功率分析工具
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linux分析rna-seq,RNA-seq数据分析（一）——Tophat篇
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RNA-seq 基本分析流程
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最近发现这个网站的博客不合适放很多文件的项目，所以需要结合github一起来记录。 第一次做RNA-seq，是完全按照这篇文章（PMID:27560171）进行跑流程的，虽然刚开始做的时候不是很懂，但是做完了整个流程（Hisat2+Stringtie+Ballgown）后，就明白了。 下载：Hisat2+Stringtie+Ballgown GFF 工具 这是17年就做好的分析，所以可能...
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qq_41909309的博客
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