PacBio相关知识

Pacific Bioscience公司简称PacBio

读长可达2-3万个碱基，平均长度8千个。

Pacbio测序也是边合成边测序。

DNA polymor固定在玻璃底板上：首先在聚合酶上标上生物素，在玻璃底板上标上链酶亲和素。利用生物素和链合亲霉素的亲和力结合在一起。

加入带四色荧光的dNTP引物，酶会长时间的抓住这个dNTP，激发光从底部照射进来，能在较长时间内发出荧光。一个循环完成后，焦磷酸基团掉落，进行第二轮，第三轮循环。

小孔设计：小孔直径70nm。

PacBio文库：DNA文库呈哑铃型。打开后即是一个圆形，可以周而复始的测序。

判读准确率：87.5%，（错误的原因可能是多读一个碱基，，错误是随机的，多读几遍之后，这些偶然误差是可以校正的。

PacBio读长的限制因素：

1，DNA链上出现缺口，激发光较强会导致DNA链出现缺口。

2，强光照射导致DNA酶变性，导致测序过程终止。

3，文库本身长度，要做20-30k的文库难度很大。

测序复合物：聚合酶，测序引物，测序模板。

一个板上有15万个小孔，由于测序复合物的随机不均匀分布，约有1/3的孔是空的，1/3的孔是一个复合物，1/3的孔有两个及以上的复合物。有效孔数约为5万个，产生的数据约为50000*8000=0.4G.

PacBio的优势：

1，PacBio可以直接测碱基被修饰的状态。如遇见甲基化的碱基，合成速度会放慢，光谱特征会改变。

2，建库过程无需PCR,由于PCR过程中AT碱基比GC碱基复制速度快，会导致最终AT的含量比较高，影响测序质量。GC bias少。

3，测序速度快：测序速度取决于酶反应速度，一秒3个碱基。