PacBio单分子长测序

PacBio单分子长测序

PacBio是目前测序长度最长的测序方法----平均读长达到8kb。

原理：

 

 

1. 用4种荧光分别标记4种dNTP

2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光波长相应的小孔，特定的孔径保证了入射光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物

3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部

4. 让DNA链与酶结合，进行测序

5. 测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板型成复合物，短暂结合

6. 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，荧光被检测到

7. 酶反应过程，一方面使链延伸，同时使dNTP上的荧光基团脱落

8. 聚合反应持续进行，测序同时持继进行

 

优点：

1. 测长很长，主力的测长可以达到8kb，见下图

2. 可以直接测出碱基修饰，当聚合酶遇到模板上甲基化的A、C等碱基时，聚合的速度明显变慢，并且光谱特征发生改变。这使直接测甲基化变得很容易，见下图：

3. 对GC含量的偏向性小，可以轻松读到高GC的区段，下图中的紫色曲线就是PacBio的覆盖度。从本质上说，是因为建库中没有PCR过程，所以也就没有因为PCR而引入的GC bias

4. 测序速度快，上机时，1秒钟测3个碱基。3个小时可以完成一个run。上机前的建库，1天完成，与Illumina或Ion Torrent的建库时间基本持平。所以，整体上，1天建库，1天上机，1天数据分析，3天可以走完一个完整流程

 

缺点：

1. 碱基的错误率：还是很高，达到12~15%。

2. 错误的类型：主要是额外插入碱基，同聚物（一串多个A、或C、或G、或T）区段尤其严重

3. 错误的原因是：以读A碱基为例，软件判断是一个A，还是二个A，是通过时间长短来确定的。而聚合酶与dNTP结合的时间是呈指数递减分布的，也就是半衰分布。所以判断不准。当遇到同聚物时，软件就更算不准，插入碱基的可能性就会增加

4. 错误的特点：随机错误

5. 错误的修正：因为是随机错误，所以测序深度增加后，可以通过统计来修正错误。 另外，可以用Illumina平台的高准确度序列来校正PacBio的序列

应用：

1. De novo，因为读长很长，所以在拼Contig时，成功率很高，可以拼出很长的Contig。并且可以轻松跨过重复序列、高GC序列。实际应用中，大家普遍用PacBio序列拼Contig，再用Illumina的序列来修正碱基

2. HLA分型，人体器官移植中，准确的HLA分型很重要。HLA是一个长片段，而且单体型对配型成功、移植成功有重要意义。现在医学上正在尝试用PacBio的序列来为HLA准确分型提供解决方案

3. 甲基化研究。Bisulfite是目前最常用的C碱基的甲基化研究手段，但是操作很复杂、后续检测也不算方便。PacBio可以直接读出多种碱基修饰，包括A的甲基化、C的甲基化、C的羟甲基化等，所以PacBio在碱基修饰研究中，有着独特的优势

4. RNA可变剪接研究。分析RNA可变剪接的前提是一个读长序列要跨过可变剪接位点的两侧，而现有的别的测序方法，因为读长较短，所以对RNA可变剪接并不是很敏感。PacBio正好补上了这一块，所以有一些专家在用PacBio研究可变剪接

5. 检测多个重复序列。有些疾病是因为一些重复序列的重复次数超过了正常的范围，如脆性X-gene病中高达750个CGG重复，以往这些序列是很难通过直接测序测清楚的，现在科学家可以用PacBio直接测这些区段了

未来的发展方向：

1. 更长的读长

   1. 目前限制读长的因素是：A.文库发生切口，或都断掉，导致模板链从酶上脱落；B.酶在激光照射和荧光基因的作用下失活。

   2. 所以，未来要做更长的读长: A.建立更长、更完整的文库构建方法。B.或者采用合成效率更高的酶，让单位时间内可以合成更多的碱基；或者采用更耐激光、荧光基团侵袭的酶；或者采用更好的荧光基因，有更好的荧光效率，以减少入射的激光强度

2. 更大的测序通量

   1. 目前的一个SMRT芯片约可以给出5万条有用的reads，并得到约0.4G的有效数据量。

   2. 目前，总共是15个孔，酶落入孔中的分布呈泊松分布，约1/3的空孔，1/3的单个酶孔，1/3的多个酶孔；其中只有单个酶孔所产生的数据是有用数据

   3. 未来，PacBio会在增大每个SMRT芯片的通量（read数）上下功夫

文库形状：

PacBio的文库形状很有趣，是一个环，中间是测序插入片段，两端是发夹形的接头，见下图：

好处：

1. 可以周而复始地测序，充分利用PacBio的读长

2. 插入序列的正向链和反向链都可以被读到，起到自我校正作用

3. 两端的已知接头序列，可以用作计数器，用于计算模板被周而复始地测了几次

 

国内服务费用：

1. 建库，试剂约￥4000，外包公司的建库服务价格约为￥8000~10000

2. 上机，SMRT测序芯片约￥4000，外包公司的服务价格约为￥6000~8000

 

国内有PacBio的机构：

1. 中科院遗传所

2. 医科院北京药植所

3. 上海南方基因中心（有公开服务）

4. 云南动物所

5. 武汉邓子新教授实验室

6. 天津生物芯片中心（有公开服务）

7. 北京海克威尔公司

 

国际上提供PacBio服务的机构：

1. Broad中心，一个SMRT run，卖$2500