在R中使用Primer3和NCBI-BLAST进行高通量引物设计

无论是芯片实验还是深度测序，高通量数据分析后都需要进行实验验证，其中PCR是必不可少的。PCR引物设计方法和软件很多，选用哪种完全取决于个人习惯和好恶，没有对错，唯一标准就是能否完成实验。这里我们用R语言整合Primer3和NCBI-BLAST进行批量引物设计。

1 Primer3 使用简介

Primer3 是PCR引物设计软件，Debian下可以直接使用新立得查找安装或者用apt-get安装。Windows下安装需要编译，如果不想或者不能自己编译就安装EMBOSS，它帮你搞好了，在安装目录下可以找到 primer3_core.exe 和 primer32_core.exe 。发表论文可以引用下面文献：

Untergrasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG (2012) 
   Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research40(15):e115
Koressaar T, Remm M (2007) Enhancements and modifications of primer design program Primer3
   Bioinformatics 23(10):1289-91

1.1 Primer3 命令行参数

命令行相当简单：

primer3_core 参数们

参数都是可选的，包括：

参数	含义
-format_output	产生易于人读的输出结果，否则产生易于机读输出（用于编程）
-io_version=n	n为3或4（默认），n=3表示兼容低版本
-p3_settings_file=<file_path>	指定p3的设置文件，用于全局参数设置
-echo_settings_file	回显p3设置文件的内容
-strict_tags	要求严格的标签
-output=<file_path>	指定结果输出文件
-error=<file_path>	指定错误信息保存的文件名
input_file	包含序列相关引物设计详细信息的文件

1.2 Primer3参数设置文件

Primer3引物设计的一些详细参数通过“标签”进行设置。与序列相关的标签名称以“SEQUENCE”开头，与引物相关的标签以“PRIMER”开头。PRIMER标签可以用于所有模板，所以又称为全局标签。标签使用 p3_settings_file 和 input_file 文件设置。

p3_settings_file 的格式为：

Primer3 File - http://primer3.sourceforge.net
P3_FILE_TYPE=settings
全局标签名=参数值
=

前两行和最后的等号是必需的。标签设置行可以有很多，无顺序，但每个标签的设置内容必需在一行内。 p3_settings_file 只能设置  PRIMER_XXX 等全局标签。

input_file 的格式为：

标签名=参数值
=

对于绝大多数的任务来说 SEQUENCE_TEMPLATE （模板序列）是必需的参数。最后的等号也必需，表示一个序列的参数