使用Misa结合Primer3来批量设计SSR引物

使用Misa结合Primer3来批量设计SSR引物
MISA，英文全称为Micro Satellite identification tool，即微卫星识别工具。
MISA是使用 perl 编写的一支程序，能识别出序列中的微卫星和复合微卫星（两个微卫星之间由由不多于100bp的碱基对隔开），并给出其所在位点。

MISA下载网址：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html

1.MISA用法：

$ misa.pl filename
misa.pl
其中，fastfile是序列文件，同时在运行程序的工作目录下必须有一个名称为“misa.ini”
的文件。该文件内容为：

definition(unit_size,min_repeats): 1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs): 100 

该文件指定了misa的参数，即1个碱基重复10次及10次以上；2个碱基重复6次及6 次以上；
3个碱基重复5次及5次以上；4个碱基重复5次及5次以上；5个碱基重复5 次及5次以上；6碱
基重复5次及5次以上，这样的碱基重复序列才算是微卫星序列。 同时，两个微卫星之间的距
离小于100bp的时候，两个微卫星组成一个复合微卫星。

MISA的输出结果：
MISA会在 Fastafile 所在的文件夹下生成两个文件，分别是 “.misa” 和 “.statistics”

“.misa” ：以表格的形式列出微卫星的类型和位点；
“.statistics” ：统计微卫星的类型和频数。

在MISA的下载页面中，提供了3个附加的 perl 脚本，分别是：Get_est_trimmer.pl，p3_in.pl 和 p3_out.pl。

由于MISA程序读取fasta文件中的序列ID，将序列ID中的空格用下划线 ”_” 填补了，所以在fasta文件中，其序列ID最好不要有空格。否则运行接下来的程序时，会出问题。

Get_est_trimmer.pl
针对EST序列，可以除去EST序列中短的序列和两端不明确的碱基。

2.第二步：

p3_in.pl 输入 misa.pl 的输出结果，将引物设计的参数文件（模板，产物长度，目标区域等）导入到一个以“p3in”为后缀的文件中。
$ p3_in.pl filename.misa

3.第三步：

primer3主设计引物脚本
$ primer3_core -default_version=1 -output=filename.p3out filename.p3in

4.第四步：

p3_out.pl对primer3产生的文件进行提取合，得到最后的结果文件 filename.result
$ p3_out.pl filename.p3out filename.misa

tips： p3_in.pl 和 p3_out.pl 这两个程序可能需要修改才能正常使用。

参考：http://www.chenlianfu.com/?p=255