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为什么要做基因表达操作?
- 探寻影响细胞表型变化(增殖、凋亡、焦亡等)相关的分子,了解这些分子之间相互作用的关系(机制)
- 分子-机制-表型的关系
- 对谁操作?
① DNA,如 CRISPR-Cas9 对细胞本身的 DNA 删除、添加或替换;最常见的操作如过表达,将外源 DNA 导入细胞,利用细胞的转录翻译系统表达相应的蛋白质。
② 利用具有干扰作用的小 RNA,降解细胞内源 RNA 或抑制翻译,从而影响蛋白质的表达量。
基因过表达操作流程
1. 构建基因过表达载体
1.1 设计 PCR 引物
(1)寻找 CDS 序列
(2)分析酶切位点:找出载体多克隆位点 MCS 有,而插入基因中无的酶切位点。
- DNAMAN 中载入 TNF 序列文件:Sequence → Load Sequence → From Sequence File → 选择前面保存的 TNF.seq 序列文件。
- 寻找 TNF 基因中的酶切位点:Restriction → Restriction Analysis → 勾选 Show summary 和 Show sites on sequence → 下一步→Select All → 完成。
- 关注输出结果中的
Non Cut Enzymes
(不会切 TNF 基因的酶切位点),找出载体(以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP
载体为例)多克隆位点 MCS 有,而插入基因中无的酶切位点。
- 找出切割效率高的酶切位点:切割效率达到 90%以上最好;排除同尾酶,即切割后的粘性末端不能一样(如 XbaⅠ和 NheⅠ是同尾酶)。常用酶切位点表(含保护碱基)
- 找出在