【实验技术笔记】利用重组载体做基因过表达（pCDH载体）

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为什么要做基因表达操作？

• 探寻影响细胞表型变化（增殖、凋亡、焦亡等）相关的分子，了解这些分子之间相互作用的关系（机制）
• 分子-机制-表型的关系
  
• 对谁操作？
  ① DNA，如 CRISPR-Cas9 对细胞本身的 DNA 删除、添加或替换；最常见的操作如过表达，将外源 DNA 导入细胞，利用细胞的转录翻译系统表达相应的蛋白质。
  ② 利用具有干扰作用的小 RNA，降解细胞内源 RNA 或抑制翻译，从而影响蛋白质的表达量。

基因过表达操作流程

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1. 构建基因过表达载体

1.1 设计 PCR 引物

• 参考：载体构建实例解析——构建 SETD3-pEGFP-N1（Snapgene 设计引物）

（1）寻找 CDS 序列

• 以 TNF 为例，将 CDS 序列复制到 DNAMAN，保存为 .seq 文件。
  

（2）分析酶切位点：找出载体多克隆位点 MCS 有，而插入基因中无的酶切位点。

• DNAMAN 中载入 TNF 序列文件：Sequence → Load Sequence → From Sequence File → 选择前面保存的 TNF.seq 序列文件。
  
• 寻找 TNF 基因中的酶切位点：Restriction → Restriction Analysis → 勾选 Show summary 和 Show sites on sequence → 下一步→Select All → 完成。
  
  
• 关注输出结果中的 Non Cut Enzymes （不会切 TNF 基因的酶切位点），找出载体（以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体为例）多克隆位点 MCS 有，而插入基因中无的酶切位点。
  
  
• 找出切割效率高的酶切位点：切割效率达到 90%以上最好；排除同尾酶，即切割后的粘性末端不能一样（如 XbaⅠ和 NheⅠ是同尾酶）。常用酶切位点表（含保护碱基）
  
• 找出在