ct报告就一定准确吗_用数字PCR进行绝对定量结果就一定准确吗？

最新推荐文章于 2023-07-21 08:55:12 发布

慈悲饮

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文章标签： ct报告就一定准确吗

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数字PCR作为核酸绝对定量技术，以其高灵敏度和准确度受到关注。但实验中，样本浓度、样本加载体积、微反应单元一致性、密闭性等因素会影响结果准确性。QIAcuity数字PCR系统通过优化这些因素，提高了检测的精确性和重复性，确保实验结果的可靠性。

摘要由CSDN通过智能技术生成

众所周知，数字PCR是继实时荧光定量PCR之后新兴起来的一种核酸绝对定量分析技术。通过将含有待测样本的数字PCR反应液分散到成千上万个独立的微反应单元中，在PCR扩增后对每个微反应单元中的荧光信号进行判读，计算出阴性和阳性反应的数量，最后利用泊松分布等统计学公式和软件对结果进行计算分析，从而实现靶标分子的绝对定量。数字PCR不依赖标准曲线定量，并且不受PCR扩增效率影响，具有更高灵敏度和准确度。

数字PCR原理示意图

然而，在数字PCR的实际检测过程中，却发现很多情况下的准确性未达到实验的预期，到底哪些因素会影响其检测结果的准确性？请听小编一一道来：

01 原始样本浓度

在进行数字PCR检测之前，需确定样本的原始浓度，从而避免由于样本浓度过高出现所有微反应单元全阳信号或浓度过低出现所有微反应单元全阴信号，导致统计学公式计算偏差而造成检测结果的不准确。一般来讲，样本的原始浓度需在数字PCR的动力学检测范围内(大多为5个数量级)，理想情况下，当阴性分区为总分区数的20.3%时，样本浓度最佳^[1]。

数字PCR实验检测浓度与分区数的关系

02 样本总加载体积

当数字PCR总分区数一定时，样本的总加载体积同样会影响到最终的检测准确性^[1]。譬如对于稀有靶标的检测，假设待测原始样本每5ul中含有1个拷贝的靶标分子，如果只取5ul参与反应，由于泊松分布的原理，这个靶标分子很可能未被包含在5ul的原始样本中。如果参与反应的样本体积增加到15ul，就会大大提高待测样本中该靶标分子的检测概率，从而提高检测结果的准确性和精确性^[2]。QIAGEN数字PCR的26K Nanoplate采用40ul超大反应体积，配合4X QIAcuity Probe MasterMix可实现高至28ul的待测样本加载量，对稀有靶标的检测非常友好。

样本反应体积与数字PCR检测结果的关系

03 反应液分区方式

目前，数字PCR的分区方式主要为固相物理分割和 “油包水” 的液滴分区两种。无论选择哪一种分区方式都可实现泊松分布概率学统计公式来校正和计算靶标分子的最终拷贝数。

然而，泊松分布计算准确的前提是需要保证每个微反应单元体积大小一致。“油包水” 液滴生成的过程中，每个液滴的体积大小无法保证完全相同。液滴之间由于液体表面张力、操作不当等影响，导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大，破裂则导致有效分区数量变少更增加了交叉污染的风险。

另外，还需注意微反应单元密闭与否^{[1] [3]}。非密闭体系在PCR反应过程中，由于受热会造成反应体系内水分蒸发，从而造成反应体系体积变小，反应浓度随之增加，同样也会导致最终检测结果的偏差。

微反应体积变化对检测精度的影响

QIAcuity数字PCR搭配的Nanoplate采用专利纳米微孔板，利用微流体技术将数字PCR反应体系分配到固相微孔中，并在分区完成后自动封闭所有微孔联通管道，真正意义上实现独立封闭微反应体系。

<< 滑动查看下一张图片 >> 04 样本反应液总有效分区数

所谓有效分区数,通俗来讲是指最终生成含有反应液的可被计算到最终统计学公式中的微反应单元数。从刚才的介绍中我们已经知道，不同的分区方式会影响到最终有效分区数。另外，如何确定实际生成的有效分区数也很关键。泊松分布统计是根据有效分区数而非理论分区数来计算的。QIAcuity dPCR MasterMix 包含特殊质检染料，配合QIAcuity数字PCR系统的参比荧光通道可实时检测实际生成的微反应单元数。实测发现QIAcuity 26K Nanoplate最终生成的有效分区数都在25000个以上，与理论值26000的一致性在96%以上，有效避免了最终无效分区的引入和有效分区数量的减少而造成的结果偏差。

左图为实际检测到的阳性反应孔信号；右图为参比荧光通道检测到的有效分区数 05 手工操作误差

数字PCR的实验操作流程与荧光定量PCR相似，不同之处在于多了一步微反应单元制备。从上面的介绍我们已经了解到，微反应单元制备的成功与否直接影响到最终数字PCR的结果。想要提高数字PCR结果的重复性及准确性，就要尽可能避免手工操作步骤的误差。QIAcuity一体化全自动数字PCR系统，只需在上样后将纳米微孔板加入仪器中就能实现微孔制备、PCR扩增、荧光数据读取全流程的自动化，有效避免手动操作引入的误差，是检测结果准确的可靠保证。

QIAcuity数字PCR工作流程

参考文献：

[1] Nivedita Majumdar,Thomas Wessel,Jeffrey Marks. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision.[J]. PLoS ONE,2017,10(3).

[2] Amar S. Basu. Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR[J]. SLAS Technology,2017,22(4).

[3] Tzonev Svilen. Fundamentals of Counting Statistics in Digital PCR: I Just Measured Two Target Copies-What Does It Mean?[J]. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.),2018,1768.