和rna用什么鉴定_重建宏转录组揭露RNA病毒参与土壤碳循环的潜力

摘要

为研究RNA病毒在土壤环境中的多样性与生态作用，本研究选取多生境、多时序的48个独立宏转录组样本，发现RNA病毒在土壤环境中是多样、丰富且非常活跃的。当病毒侵染造成宿主细胞死亡时，会推动土壤中的碳循环中常常被忽略的部分。

编译：彭玺

英文标题： Metatranscriptomic reconstruction reveals RNA viruses with the potential to shape carbon cycling in soil 中文标题： 重建宏转录组揭露RNA病毒参与土壤碳循环的潜力 期刊： PNAS, 2019 第一作者： Evan P. Starr ¹ 通讯作者： Mary K. Firestone ^2,3 作者单位： ¹Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, CA 94720; ²Earth Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720; ³ Department of Environmental Science, Policy, and Management, University of California, Berkeley, CA 94720;

前言

现阶段，细菌和古菌在土壤中的多样性和生态学研究随着组学技术的进步而有了迅速的发展，而对于土壤中病毒的研究才刚刚起步。现在已有的研究中有对双链DNA噬菌体多样性及其与宿主的相互作用的研究，可对诸如RNA噬菌体、真核RNA病毒等的研究还存在空白。RNA病毒在环境中较少被研究到，因为它们一般不会在针对DNA测序研究中被提取到。在某些生态系统中，已经有RNA病毒对群落和生态系统过程的影响能与DNA病毒相提并论甚至更甚的观点。大多数土壤RNA病毒的工作都是针对农业相关农作物或病原体展开的，RNA病毒的研究环境则更多是海洋环境和人、动物肠道。此前尚无针对土壤环境使用基于测序的RNA病毒群落分析研究。

病毒被认为是生物地球化学循环的主要参与者的许多依据都来自于水生系统的研究，代表为“病毒分流(the viral shunt)”现象：海洋噬菌体每日最多可溶解海水中1/3的细菌，释放大量碳，包括被异养细菌代谢的有机碳。大多数病毒对碳循环影响的研究都以DNA噬菌体为对象，可是在某些情况下，RNA病毒远超DNA病毒，暗示了它们在这样生态系统中的影响。研究者推测RNA病毒对宿主的裂解作用对土壤中碳流具有相当大的贡献，细胞裂解与生物碳的释放会刺激异养菌的消耗，其中很大一部分以二氧化碳形式去往大气，矿物-有机质缔合的产生会保护释放的细胞碎片免受其它微生物的降解。对土壤病毒的多样性与生态学研究在生物技术层面上有很大的意义，可以被用于生物杀虫剂和自组装纳米材料的研发和制备。

材料与方法

本文作者团队使用来自加州一年生草地(wild oat，Avena fatua)土壤的组装宏转录组数据来发现RNA病毒基因组序列并对其可能宿主进行推测。研究人员在组装序列中搜索了RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)，这是在所有无DNA阶段的RNA病毒中发现的保守基因。土壤真核生物可能充当RNA病毒宿主的多样性研究尚不完善。通常，除了某些变形杆菌，RNA病毒还可以感染真菌、植物、动物和许多单细胞生物。土壤真核生物研究非常依赖基于引物的测序或目测分类，这些方法会有偏差和遗漏。利用组装的转录组中包含的基因组信息，研究者无需依赖引物或显微镜就能鉴定出许多真核生物进化枝。与许多其他环境病毒研究不同，后者对提取的病毒颗粒进行测序，研究者团队对整个样本进行了测序，其中包括病毒基因组和可能的宿主转录本。这种方法使研究人员既可以探索以标准方法测序的细胞外病毒，又可以在感染过程或潜伏期间探索宿主细胞内的病毒。研究者团队跟踪了目标土壤生境中的病毒和真核生物群落：根际(受根影响的土壤)，碎屑层(受腐烂的颗粒有机物影响的土壤；非根际土+凋落物)，两者(根际+凋落物)的组合以及使用相对较短的采样时间尺度(3、6、12和22天)的原位土壤(非根际土)。

 

实验结果

1.真核RNA病毒

本文作者团队使用隐马尔可夫模型(HMM)来搜索组装的宏转录组，共发现3884个独特的病毒RdRp序列(99%AAI，氨基酸一致性)，其中包括感染细菌的1350种，感染真核生物的2534种。实验中，真核病毒分为15个主要进化枝，涵盖了大多数已知病毒多样性，对其余部分，也构建了系统发育树以定义其他病毒家族(图1)。在既包含已知序列又包含新找到序列的树中，注意到RNA病毒序列分组性能很好，每组内包含一条曾用于提出新病毒家族的参考序列。

图1 实验土壤中鉴定出的代表RNA病毒进化枝的进化树(基于RdRp)。 每棵树中，确定的RdRp序列被染成紫色，而已知的参考序列被染成粉红色。

之前，包括线粒体病毒(mitoviruses)在内的Narnaviridae科被认为是仅编码RdRp，但新的研究发现一些Narnaviridae病毒编码其他蛋白质，包括衣壳和解旋酶。本研究鉴定了一些可能带有其他基因的线粒体病毒基因组，这些基因可能会影响感染效率或对新宿主的侵染。但大多数鉴定出的线粒体病毒仅仅包含RdRp基因，作者团队预测了一些接近完整的线粒体病毒基因组上的其他基因的蛋白质，推定的这些基因很小，平均翻译长度在79个氨基酸，功能无法预测。针对可能会感染真菌以外的真核生物的病毒重现了许多序列，对于Picorna-Calici，根据系统发育位置推定更有可能以脊椎动物、昆虫、藻类和植物为宿主，而在Tombus-Noda树中，大多有幽影病毒属(umbraviruses)序列，这是被广泛认知的植物病毒。在类Nidovirales、类Reoviridae和类Orthomyxoviridae超家族中缺少土壤RNA病毒，也未能准确鉴定出能由DNA中间产物复制的任何逆转录病毒。作者团队鉴定了许多逆转录酶，但没有相应的支架编码衣壳蛋白，因此序列可能是逆转录转座子或逆转录病毒的片段。Bunya-Arena病毒超家族中的2个进化枝被归为新进化枝，它们表现出的序列差异与分离已知RNA病毒家族的序列类似。

2.真核宿主

为了解土壤中RNA病毒宿主和载体的多样性与生态学，作者团队使用线粒体编码的细胞色素C氧化酶亚基1(Cox1)基因标记真核生物。共鉴定了726个真核Cox1序列，并将其按98% AAI进行聚类，所发现的真核生物范围跨越了已知土壤生物的多样性。来自A. fatua的序列是多数样品中最丰富的。变形虫是该数据集中最多样化的真核生物进化枝，占已鉴定真核生物的25%以上。还有许多未知的真核生物反映的问题是参考数据库中微(micro-)真核生物和中(meso-)真核生物缺乏环境Cox1序列。因此，作者团队对18S rRNA序列进行重现以分类，但分析的转录本在细菌和植物rRNA的Ribo-Zero rRNA去除试剂盒中被除去，这影响了其他rRNA序列的组成和相对数量，因此，已鉴定的18S rRNA序列不能用于丰度测量或多样性的定量，只能用于鉴定未使用Cox1鉴定的真核生物。基于18S rRNA序列(按98%核酸一致性进行聚类)共鉴定521个物种(表1)。

3 .真核病毒和宿主生态学

根凋落物的存在改变了土壤的真核生物群落结构，如图2A的NMDS结果所示，其统计学依据为PERMANOVA R2: 0.17，P<9.999e-05。第一次采样(3d)时就出现了明显的群落分化，并一直持续至22d。根凋落物和根际环境的存在丰富了许多变形虫与真菌，但富集模式表明凋落物对更多个体物种的选择作用要大于根。真核RNA病毒群落结构则受实验处理的影响，根凋落物对真核RNA病毒群落具有显著影响(PERMANOVA P<9.999e-0.05)，而根的存在并无显著影响(PERMANOVA P<0.07)(如图2B所示)。3d内，有无凋落物样本之间的差异是显著的，这表明病毒和真核生物群落以相似的速率变化，差异一直持续到22d实验结束。即使从数据集中删除了Narnaviridae，也能观察到同样的模式，这表明基于根凋落物，这样大量、与宿主结合的异常病毒并未引起真核病毒群落的差异。与富集真核生物的数量相比，也有数量较少的富集真核RNA病毒被鉴定，这可能是由于病毒丰度模式存在很大的异质性，甚至是在重复实验中也是如此。RNA病毒显示出比真核生物更高的微异质性。

4.RNA噬菌体、潜在宿主及其生态

已知有两个RNA病毒家族可感染细菌，即Cystoviridae(囊状噬菌科，感染假单胞菌)和Leviviridae(光滑噬菌体科，感染γ-变形菌和α-变形菌)。作者团队用标记基因的方法在组装的转录本中为这些RNA噬菌体找到RdRp序列。删除重复后，确定12个囊状噬菌科RdRp序列和1338个光滑噬菌体科RdRp序列(当前公共数据库中仅有200多个光滑噬菌体科RdRp序列)。在非根际土中富集的特定光滑噬菌体科在系统发育上相对较新，并且具有基于宏基因组重现的非常规遗传结构。48个样本中，有46个样本里最丰富的的光滑噬菌体科序列组成了一个主要新分支，这种丰富的RNA噬菌体的近乎完整的4668bp基因组编码了4个不重叠的基因，这与在其他光滑噬菌体科中经常重叠且基因数目较少是相反的。与肠杆菌噬菌体M一样，它也可以在RdRp基因内部编码+1移码裂解蛋白。相关光滑噬菌体科病毒基因组更为复杂，有5个基因，可能还有2个移码裂解蛋白。作者团队使用核糖体蛋白S3(rpS3)的系统发育来鉴定光滑噬菌体科病毒的可能宿主，鉴定出355种变形杆菌，其根际土、非根际土、根际+凋落物和非根际+凋落物处理之间的丰度在3d开始就显现出显著差异(PERMANOVA P<9.999e-05)。光滑噬菌体科病毒群落同样在3d时就产生了分化并随时间而变化(PERMANOVA P<0.02，图3A)，依据根凋落物的有无区分出的群落具有显著差异(PERMANOVA P<9.999e-05)，而根的有无所带来的影响则是不显著的(PERMANOVA P<0.09，图3B)。

讨论

在本研究中，真核RNA病毒和真核生物群落均受到腐烂的根凋落物的影响。在第一采样时间点前，真核生物与和真核生物相关的RNA病毒群落都随凋落物的存在与否而不同。腐生真菌对凋落物生物量表现出了相当的反应。相反，非真菌的土壤真核生物可能较难获得由根系渗出的可溶有机化合物。因此，根对非植物真核生物群落组成的影响很小。添加了腐烂植物生物量促进了有害生物的活动，这些生物很有肯恩从周围的土壤进入到了凋落物中，增加了转录水平，通过孢子生长和(或)发芽。然而，研究团队观察到的真核RNA病毒群落的变化可能是由于其宿主活性上升后的增殖所致，尽管它们可能已经出现了载体转运。通过对RNA病毒和可能宿主间的网络分析，得到的真菌与Narnaviridae的共生链接数量最多提供了表明真菌可能是该土壤中RNA病毒的宿主的证据。变形虫具有最多的共生链接，包括与光滑噬菌体科的3个共生链接，他们不太可能感染变形虫本身，但可能与共生细菌有关，仅知道有一种RNA病毒会感染变形虫，是一种单株病毒(Mono-Chu)，这些结果表明变形虫和病毒Bunya-Arena进化枝间可能存在联系。最大的模块包含系统发育多样的真核生物和病毒，包括与多个宿主进化枝相连的单一病毒类型，这可能代表一组对相似环境或生物条件有相应地共现体。 鉴于本文数据集中所有已鉴定的RdRp序列中有超过一半是光滑噬菌体科，作者团队鼓励进行其他研究(在其他土壤类型，土地利用，耕作方式和植被覆盖下)以评估土壤是否普遍具有光滑噬菌体科的多样性。由于光滑噬菌体科病毒没有已知的溶原性生命阶段，因此大多数种群变化可能反映了宿主的复制。由于在研究者团队实验的前3d内，光滑噬菌体科及其宿主变化明显，因此研究者团队得出结论，这些RNA病毒在几天之内感染并复制。在此时间范围内的感染可能会对寄主群落产生巨大影响，从而对土壤生态产生巨大影响。RNA病毒、噬菌体在样品(包括重复样品)中呈现异质分布。病毒和噬菌体的丰度不仅取决于宿主的存在，而且还取决于导致宿主土壤中病毒分布不规则的因素。此外，病毒在土壤中具有不同的释放速率和持续时间，这可能受到多种因素的影响，例如土壤类型，病毒种类，宿主生理，释放的微部位，黏土含量和胞外酶。对于具有胞外生命阶段并且对专一细胞内病毒(如Narnaviridae)的影响较小的病毒，这种影响最为明显。 总的来说，病毒对土壤碳循环的影响程度尚未得到充分研究。关于噬菌体在土壤中引起细菌裂解的研究很少，关于病毒引起的真菌和其他真核生物死亡的研究也很少，与某些土壤中的细菌相比，真菌和其他真核生物的生物量相等或更大。除裂解外，真菌病毒还可对真菌生物学、发病机理、共生关系和其他生理影响产生微妙而深远的影响。病毒对真菌生物学的这些影响可能会影响真菌的功能，进而影响整个土壤的性能。 在本文使用的样本中，已鉴定出的RNA病毒的高度多样性和丰富性，以及其动态种群变化表明存在大量病毒复制。假设这些裂解性RNA噬菌体和RNA病毒的增殖将对土壤中碳化合物的形式，丰度和分布以及土壤真菌的生物学和适应性产生重大影响。例如，宿主细菌细胞的裂解和真核生物的病毒诱导的细胞死亡将导致释放溶解的低分子量碳化合物。它们很可能会被附近的细菌迅速消耗掉，并且大部分碳以二氧化碳的形式被回到大气。但是，当海雪(marine snow)沉入深海时，一部分细胞和病毒碎片以及释放出的可溶性碳可能会在土壤中稳定下来。

结论

通过在对照试验基础上重现从多个土壤生境和时间点得到的土壤宏转录组数据，对RNA病毒的多样性认知程度得到了加深。系统发育分析表明，真菌是本实验草地土壤中最常见的RNA病毒宿主。真核生物、RNA噬菌体和病毒的丰度在几天内的变化表明，整个土壤群落都可以对资源的变化做出迅速的反应，碳输入(来源于根的小分子量碳输入和来源于凋落物的大分子碳输入)可能会影响真核生物和细菌的丰度模式，而这些反过来又可能决定了RNA病毒和噬菌体动力学。

参考文献：

Starr EP, Nuccio EE, Pett-Ridge J, Banfield JF, Firestone MK: Metatranscriptomic reconstruction reveals RNA viruses with the potential to shape carbon cycling in soil. Proc Natl Acad Sci U S A 2019, 116(51):25900-25908.

原文链接：

https://www.researchgate.net/publication/337554054_Metatranscriptomic_reconstruction_reveals_RNA_viruses_with_the_potential_to_shape_carbon_cycling_in_soil

  

中国科学院生态环境研究中心

环境生物技术重点实验室

邓晔 研究员课题组发布

作者：彭玺

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