宏转录组方法_土壤宏转录组RNA的提取方法评价

微生物被认为是地球最大的分解者。据估算，每克土壤中微生物的数量最高可达上百亿，物种可达数十万种[。这些数量巨大、种类繁多、功能多样的微生物推动了土壤的发生和发育，决定了地球演化的方向和进程，形成了人类赖以生存的土壤历史自然体。然而，栖息于土壤中难以计数的海量微生物中，绝大多数被认为难以培养、生理功能未知，最高可达99%之多，学术界甚至将其类比为物理学中的暗物质，提出了生物暗物质的理念[。因此，如何认知这些尚未培养微生物的生理功能及其在原位复杂地球环境中的作用，一直是学术界研究的热点和难点。

宏转录组被认为是研究微生物原位功能表征的重要技术。宏转录组以复杂环境中微生物群落的总RNA转录本为具体研究对象。而RNA的存在，在很大程度上表明特定的微生物处于生理活性状态，可能在复杂系统的物质和能量代谢过程中发挥着重要作用。与宏基因组相比，宏转录组具有明显的原位研究优势[，因为DNA水平基因的存在和检出，并不意味着该基因转录表达并发挥作用，特别在复杂土壤中同时存在数以亿计的微生物，这些微生物很难同时大量分裂、增殖并产生大量新生细胞而发挥重要功能，大多时候原位海量的微生物细胞可能在未增殖的情况下也在发挥作用，因此，以RNA分析为核心的宏转录组技术在研究原位微生物功能、发掘活性微生物资源方面具有天然的技术优势。然而，原核微生物mRNA稳定性差，降解速度快(以秒计)；且占总RNA比例仅为5%左右，因此，与宏基因组相比，宏转录组操作复杂，技术要求高。例如，以宏转录组Metatranscriptomic*为关键词，在Web of Science核心数据库可检测到612篇论文(截止到2018年3月6日)，其中包括104篇土壤转录组论文，141篇海洋转录组论文。而宏基因组论文则高达8997篇，约为宏转录组15倍之多，土壤和海洋相关分别为1496篇和1245篇。这些结果表明，与海洋相比，土壤环境更为复杂，土壤宏转录组难度大于宏基因组，土壤RNA的提取和纯化，则是宏转录组研究的难点。

传统的宏转录组研究主要以mRNA为核心开展测序分析，从土壤总RNA中除去核糖体rRNA并富集mRNA是关键技术[，但由于早期测序成本较高，而细胞体内rRNA占比高，测序通量较低的情况下，只能检测到极少量的mRNA。例如，E. coli中rRNA占细胞干重可达16.8%，而mRNA占比仅为0.8%[。同时，由于mRNA降解以秒计，准确评估不同方法所得mRNA是否代表了土壤及其他环境中的主要微生物类群，具有极大的挑战[。已有研究通过提取土壤总RNA反转录获得cDNA后，比较其中mRNA和18S rRNA基因的组成，结果发现两者代表的物种组成具有极大差异，并不一致[。此外，由于相当数量的基因功能未知，mRNA作为生物分类的分子标靶不具有普适性，针对mRNA的宏转录组技术评价，通常具有较大的技术难度。然而，理论上而言，宏转录组的核酸序列均来自于完整细胞，同时16S rRNA被认为是生物分类的重要标准，在学术界得到广泛认可。因此，通过对宏转录组总RNA中rRNA序列组成的系统分析，即可初步评价总RNA所代表的土壤微生物细胞及其主要类群，也为后续分析mRNA提供了重要的参考策略。

据此，我们提出了本研究的科学问题：(1)不同的土壤RNA提取方法是否存在方法本身的专一偏好性。例如，无论何种土壤，试剂盒提取RNA是否会导致某种原核微生物类群始终被偏好性提取；(2)不同方法提取RNA能否获取土壤中主要的原核微生物类群；(3)不同RNA提取方法所得到的研究结论是否具有一致性。针对不同母质发育的3种典型水稻土(黑龙江海伦、江苏滨海、江西鹰潭)，采用两种常规的土壤RNA提取方法(手工MR法和试剂盒KR法)，通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR和高通量测序16S rRNA技术，我们比较了三种水稻土之间活性原核微生物的差异，包括水稻土RNA质量、微生物群落结构以及好氧甲烷氧化功能微生物组成，比较了手工MR提取RNA与试剂盒KR法的结果一致性，期望为土壤原核微生物宏转录组研究提供有益参考。 1 材料和方法

1.1 土壤样品描述

土壤样品均采集于我国典型水稻种植区，包括黑龙江海伦(HL)，江苏滨海(BH)和江西鹰潭(YT)，具体采样的经纬度和土壤母质信息见

表 1. 供试水稻土的地理位置和基本理化性质

Table 1. Geographic locations and physiochemical properties of paddy soils in this study

No.

Sampling site

Geographic locations

pH (H2O)

Total N/

(g/kg soil)

Total organic carbon/

(g/kg soil)

Soil type

1

Hailun city

N47°26' E126°38'

5.97±0.06

2.65±0.01

34.10±0.20

Mollisol, Sandy soil

2

Binhai city

N33°59' E119°47'

7.95±0.04

1.44±0.07

25.10±1.42

Inceptisol, Sandy loam

3

Yingtan city

N28°23' E116°82'

5.77±0.03

1.38±0.02

13.17±1.00

Quaternary red lay

1.2 水稻土转录组总RNA提取

水稻土预培养：将长期低温保存的风干土壤加入适量水分并恒温培养，为可能休眠的微生物细胞复活尽可能提供最佳环境条件。具体操作包括：称取相当于5 g干土的水稻土置于120 mL的血清瓶中；加入无菌去离子水调节土壤水分含量至最大持水量的60%；加丁基橡胶塞密封瓶口，并用铝盖加固；将培养瓶置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d后收集水稻土。一部分水稻土(2 g)保存于2.0 mL带螺帽口的裂解管(0.5 g/管)，立即加入RNA later保护水稻土RNA，并放置于-20 ℃，用于手工提取法(MR)水稻土RNA提取；另一部分水稻土直接保存于-80 ℃超低温冰箱，用于试剂盒法(KR)水稻土RNA提取。

手工提取法(MR)：根据已有参考文献[later保护液；(2)向管中加入0.5 g玻璃珠(0.5 mm:0.1 mm=3:2，Sigma)和700 μL预冷的TPM裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 5.0，1.7% polyvinylpyrrolidone，20 mmol/L MgCl2)，在核酸裂解仪(Fast PrepTM FP120)以6 m/s的速度振荡35 s，随后将剧烈振荡的裂解混合物在20000×g条件下离心2 min，上清液转移至2.0 mL的无菌离心管中；(3)再向裂解管中加入700 μL预冷的PBL裂解液(5 mmol/L Tris-HCl pH 5.0，5 mmol/L EDTA-2Na pH 8.0，0.1% SDS，6%水饱和酚)，使用核酸提取仪在相同的条件下振荡，振荡后将上层裂解液与之前的上清合并；(5)向两次合并上清的离心管中加入500 μL的水饱和酚(pH 4.5)，上下振荡30次后离心2 min；将上清轻轻吸出转移至新的2.0 mL离心管中；再依次加入500 μL的氯仿：异戊醇(25：24：1)(pH 4.5)、氯仿：异戊醇(24：1)，用相同的方法振荡、离心、回收上清液；(6)最后一次上清转移至1.5 mL的离心管中，加入2倍体积的PEG-NaCl溶液(30% PEG-6000，1.6 mol/L NaCl)，混匀后室温静置2 h；(7)将离心管在常温下20000×g离心10 min，倒去液体，加入400 μL 70%乙醇洗涤沉淀；20000×g条件下离心5 min后用枪头轻轻吸去乙醇溶液；(8)将离心沉淀在无菌通风厨中晾干5 min，用50 μL DNase/RNase-free H2O溶解RNA；(9)加入Recombinant DNase Ⅰ (TaKaRa)除去溶液中的DNA成分；(10)使用RNeasyMinElute cleanup Kit (QIAGEN)试剂盒纯化得到最终的RNA，每个样品的每个重复提取2 g土壤并溶于60 μL DNase/RNase-free H2O中，RNA提取物保存于-80 ℃超低温冰箱备用。

试剂盒提取法(KR)：采用目前市场流行的PowerSoilTM Total RNA Isolation Kit (MoBio)试剂盒，提取水稻土转录组总RNA，每个水稻土设置3