c235delc杂合变异遗传吗_20 个遗传性耳聋家庭的产前诊断

　　耳聋是严重影响人们生活质量的残疾之一。据2006 年统计，我国的听力障碍患者人数已经高达2780 万，在各类残疾中高居第二位[1]。每1000 名新生儿中，就有1~3 例出现听力异常[2,3]，推测目前我国的耳聋人群数目会更加庞大，防聋形势非常严峻。耳聋发病原因分为遗传性因素和环境因素[4]。其中由基因缺陷造成的耳聋大约占60%[5]。流行病学调查显示，GJB2、SLC26A4 和线粒体12S rRNA 是我国最常见的耳聋基因[6-8]，约44.76% 的先天性聋因这三种基因变异所致[8]。在本研究中，通过耳聋基因筛查，明确聋人家庭中先证者病因，且患者父母双方均是致病基因的携带者，指导患者母亲在孕期进行产前诊断。产前诊断在耳聋患者家庭的再生育中对防止聋儿的出生有着重要的意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象

20例经基因检测明确为遗传性感音神经性聋患者，均就诊于空军军医大学西京医院耳聋咽喉头颈外科。通过行为测听、声导抗、耳声发射、听性脑干反应以及颞骨CT、MRI扫描及全身体格检查，排除了综合征型聋。20个遗传性聋家庭均有强烈的再生育要求。本项目对家庭成员进行详细的问询，包括基本信息、先证者耳聋相关病史、既往史、家族史以及先证者母亲孕期身体状况、用药史、外伤史等。

1.2 方法 1.2.1 基因检测

采集先证者及其父母的外周血3ml，EDTA 抗凝，百泰克中量全血DNA提取试剂盒提取血液基因组DNA，Nanodrop 微量分光光度计测定DNA 的纯度和浓度，取适量样本稀释至浓度为100~200ng/μl 后，其余-20℃保存。对常见耳聋基因的GJB2 编码区、SLC26A4 编码区外显子及剪切位置附近[9]、线粒体12S rRNA 的m.1494 和m.1555 位点进行Sanger测序分析。

比对先证者与其父母的基因型后，向患者家庭提供详细的耳聋遗传知识，并给予科学的遗传咨询。孕妇进行产前诊断前，签订产前诊断知情同意书，根据孕期时间决定超声引导下绒毛膜或羊水取材[5, 10]。若孕期10~13 周，行绒毛膜活检术抽取胎盘绒毛10mg；若孕期16 周以上，抽取羊水20ml。用QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒提取绒毛膜或羊水DNA；针对该家庭相应的耳聋致病变异进行Sanger测序，明确胎儿基因型。

1.2.2 STR 基因型检测

为了保证样品的准确性并排除母体污染[11]，选取3 个STR 位点(D21S2019，D21S1440，D21S1411)在ABI3130 测序仪上分别对相关家系中母亲、父亲及胎儿的DNA 进行检测。利用GeneMapper 软件自动分析等位基因的基因型。

2 结果

2.1 20 个聋儿家庭基本情况

20 个家庭中先证者的父母听力均为正常，其中F1~F10 家庭中先证者的CT、MRI 未显示异常；F11~F20 先证者的CT、MRI 结果显示双侧前庭导水管扩大(Enlargement of the vestibular aqueduct，EVA)。CT 诊断的标准是利用Valvassori规定[12]，半规管总脚到前庭水管外口1 / 2 处直径(Midpoint Measurement，MP)≥1.5mm 或前庭水管外口直径(Operculum Measurement，OP)≥2mm 即为大前庭导水管综合征。这20 个家庭的基本情况及临床表现，详见表1。

2.2 20 个家庭中父母耳聋基因型检测结果

采用Chromas 软件对Sanger 测序结果进行分析，使用DNAMAN软件进行序列比对分析。以GenBank 中GJB2 基因序列(ID: 2706)及SLC26A4 基因序列(ID: 5172)为标准比对序列，检测结果见表2。查询疾病数据库http://davinci. crg. es / deafness /index. php?seccion=mut_db&db=nonsynd&nonsynd=cx26mut 和http://deafnessvariationdatabase.org /gene_page / SLC26A4 网站，根据ACMG 指南明确GJB2 基因和SLC26A4 基因变异类型的致病性。这20 组家庭中共检出11 种GJB2 基因变异和11 种SLC26A4 基因变异，均为隐性致病变异。对比20组感音神经性聋家系的先证者与父母基因型，明确10 组家庭的胎儿需要进行GJB2 基因相关的致病变异检测，10 组家庭需要行SLC26A4 基因相关的致病变异检测。

2.3 胎儿的基因型及出生后随访结果

20 例样本中，共有绒毛膜样本12 例，羊水样本8 例。基因检测结果显示：6 例胎儿未遗传到父母任一方的耳聋致病变异；10 例胎儿遗传到父母其中一方的耳聋致病变异，为GJB2 基因或SLC26A4基因单杂合变异携带者；以上16 组家庭选择继续妊娠，胎儿出生后均通过新生儿听力筛查。4 例胎儿的基因型与家庭先证者基因型相同，推测出生后听力状态会重复先证者听力水平，4 组家庭自愿选择终止妊娠。详细结果见表3。

STR 检测结果显示，胎儿体内均携带了其父母的单等位基因STR，未发现其母亲的双等位基因STR，排除了样本的母体污染。

3 讨论

耳聋的产前诊断是在明确先证者分子学病因，且致病变异分别来自于父母双方的前提下，在检测前告知夫妻双方仅针对明确的致病变异对胎儿绒毛膜或羊水样本进行的一种检测。

胎儿样本的选择取决于孕妇妊娠的不同阶段。早期10~13 周，行绒毛膜活检术抽取胎盘绒毛检测。妊娠中期16~24 周，抽取羊水检测。本研究对20 个家庭进行了产前诊断，12 位孕早期孕妇进行绒毛膜检测，8 位孕中期孕妇进行了羊水检测。由GJB2 基因和SLC26A4 基因的致病变异导致的耳聋患者约占总耳聋人群的42.76%[8]。在本研究，F1~F10 家庭的先证者由于GJB2 基因发生了双等位基因变异导致感音神经性聋。F11~F20 家庭中先证者由于SLC26A4 基因变异致聋。GJB2 基因定位于人类的染色体13q11-q12，全长4804bp，有两个外显子，其编码区位于第二个外显子，编码缝隙连接蛋白26(connexin 26,cx26)。SLC26A4 基因与大前庭导水管综合征高度相关。在临床检测中，GJB2 基因和SLC26A4 基因全编码区序列进行分析，可明确大部分遗传性聋患者的遗传学病因，这将有助于感音神经性聋家系的遗传咨询及产前诊断。

本项研究对象中，有3 个特殊病例。家庭F6：先证者同时携带了GJB2：c. 134G>A，408C>A /c.312del14bp 三个致病变异，父亲为GJB2：c. 312del14bp 杂合变异，母亲为GJB2：c. 134G>A，408C>A 双杂合突变，说明c.134G>A，408C>A 这两个杂合变异位于同一条染色体上。胎儿仅遗传了母亲的c.134G>A 和408C>A 双杂合变异，预计出生后的听力状态与母亲相似，耳聋风险较低，该夫妇决定继续妊娠。同一条染色体上检出同一基因的两种致病变异在临床中相对少见，但也给临床基因检测工作提出了警示：先证者及其父母均需接受相同基因检测。尤其在产前诊断中，除了必须明确先证者基因型以外，还须确定致病变异确实分别来自父亲及母亲。

家庭F1：先证者基因型GJB2：c.235delC 纯合变异，母亲携带了GJB2基因c.235delC 杂合变异，父亲同时携带了GJB2 基因c.235delC 杂合变异和SLC26A4 基因c.2009T>C 杂合变异。胎儿绒毛膜样本基因检测结果显示，同时携带GJB2 基因c.235delC 杂合变异及SLC26A4 基因c.2009T>C 杂合变异，耳聋风险低，该夫妇决定继续妊娠。

家庭F3：先证者基因型为GJB2 基因c.235delC纯合变异，母亲携带了GJB2基因c.235delC 杂合变异，父亲同时携带了GJB2 基因c.235delC 杂合变异和SLC26A4 基因c.1300G>A 杂合变异。胎儿羊水样本基因检测结果显示，这三个位点均是阴性，耳聋风险较低。

F1 和F3 家庭给我们的提示是，在产前诊断中，不能只验证先证者的致病变异，还需要给父母检测GJB2 基因、SLC26A4 基因、线粒体12S rRNA 基因m.1494、m.1555 位点，否则可能给这个家庭留下隐患。

耳聋产前诊断的意义除了提前了解胎儿基因型以预估出生后听力状态外，更重要的是为接受产前诊断的家庭提供持续的遗传咨询。在这20 组受试家庭中，除了6 例胎儿的受检基因型均为阴性外，有10 例胎儿虽然出生后耳聋风险较低，但仍为耳聋致病变异携带者。待其成年后，其婚配对象仍然有必要进行相关耳聋基因检测，若同样为相同基因的致病变异携带者，其后代出现耳聋的风险仍然较高。

目前，在临床检测中，常规检测的耳聋基因是GJB2 基因、SLC26A4 基因、线粒体12S rRNA 基因，主要是因为这三个耳聋基因的致病变异在人群中携带率最高。目前已明确的耳聋相关基因多达121个(https://hereditaryhearingloss.org/)，若先证者此三项基因检测为阴性，在进行孕前指导时，也不能完全排除其他基因致病的可能[13]。需要医生根据先证者的家族遗传史及先证者的病症，再决定是否扩大耳聋基因筛查范围。

来源： 中华耳科学杂志