非生长偶联发酵改造_基因组规模代谢重排提高非天然产物靛蓝苷合成规模

Genome-scale metabolic rewiring improves titers rates and yields of the non-native product indigoidine at scale

杂志：Nature Communications

DOI：10.1038/s41467-020-19171-4.

发表时间：2020.10.23

通讯作者：Aindrila Mukhopadhyay教授，美国能源部联合生物能源研究所首席科学家，主要研究方向1.开发高性能微生物宿主；2.细菌中的信号转导和响应调节；3.测试小分子对微生物，植物微生物和后生动物系统的影响；4. 开发设计人工生物合成途径。

文章背景：

不同微生物内在代谢物的潜力不同导致同一化合物在不同的宿主中的理论转化率是不同的，选择目标产物的最佳宿主对开发理想的生产平台是至关重要的。基因组尺度代谢网络模型是微生物定向改造中一种不可缺少的指导性工具，可降低菌种改造的盲目性，增加目的性和成功率^[1]，目前已经超过500个基因组尺度代谢模型可被利用。计算建模结合基因组尺度模型已成为代谢工程学的重要方法，不仅可以深入了解代谢网络的性质和生产能力，而且还可以确定合理的代谢干预策略，以设计和优化微生物生产生物。

在过去的十年中，与计算建模设计菌株特别相关的一项关键原则是将细胞生长与所需代谢产物的生产耦合在一起。其中心目标是使所需的代谢产物成为生长及其产生的强制性副产物，从而成为有机体代谢功能的组成部分，微生物的生长成为生产的驱动力^[2]。

最近，基于约束最小割集(cMCS)的计算建模方法表明，从理论上讲，大多数代谢产物的产生可以通过消除最少的代谢反应而与生长强偶联。最小切割集的方法通过移除代谢反应的最小集合来达到强生长偶联，强生长偶联被定义为代谢路线的重排，即使细胞不生长，目标产物也能够合成。

本文作者测试了异源化合物的生产与微生物生长耦联的可能性，以及这种耦联是否会导致较高的TRY(产量，速率，转化率)以及在不同的生长方式和发酵规模上维持生产参数的能力。他们通过利用最小切割集的方法计算干预策略，结合组学，生长必须基因数据库，从63个解决方案集中筛选得到一种需要同时下调14个基因的方案集。利用多重CRISPRi技术对菌株的代谢路线进行重排，构建能够高效合成靛蓝苷，一种蓝色染料，实现了25.6g/L，0.22g/L，50%的最大转化率的工程菌株。

图1 生长与生产耦合的菌株设计策略^[2]

研究内容：

1.     基因尺度评价恶臭假单胞菌(P. putida)用于强生长耦联

利用约束最小割集(cMCS)算法结合P. putidaiJN1462基因组尺度模型，以及基因蛋白反应关系(GPRS)和必需基因数据库，通过输入最大理论转化率(MTY)和生物量转化率(YBS)，从63个解决方法集合中筛选得到一种需要同时干预14个基因的可行的高产靛蓝苷的方案集。

图2 约束最小切割集建模流程图

图3 约束最小切割集预测基因干扰策略

2.      构建多重基因编辑工程菌

首先在恶臭假单胞菌中异源表达了来源于淡紫灰链霉菌非核糖体肽合成酶(BpsA)，以及来源于枯草芽孢杆菌泛素化酶(Sfp)，构建能够生产2.3g/L靛蓝苷的工程菌。同时表达半乳糖利用操纵子(galETKM)，构建能够以半乳糖为底物合成靛蓝苷的工程菌。利用多重CRISPRi技术对cMCS预测干预代谢反应基因集合中的14个基因进行基因表达抑制。RNA-seq结果表明多重CRISPRi技术可以实现靶标基因mRNA表达水平50%的下降，同时靶标基因蛋白表达水平也有着相应的下降。

3.      表征多重基因编辑工程菌

以葡萄糖为底物，深孔板发酵表明，与对照菌相比工程菌生产靛蓝苷的产量提高了3倍，摇瓶发酵靛蓝苷的产量提高了30%，2 L批发酵实验表明，与对照菌靛蓝苷产量5g/L相比，工程菌生产靛蓝苷的产量提高了2.5倍，产量达到12.5g/L。

以半乳糖为底物，深孔板与摇瓶发酵实验表明，工程菌主要形成了生物量。在2 L批发酵实验表明，工程菌生产靛蓝苷的产量提高了28倍，产量达到25.6 g/L。

总结：

本文利用最小切割集cMCS算法，计算代谢反应的干预策略，实现在恶臭假单胞菌中异源生产高产量的靛蓝苷。此技术也可以用于理性设计其他化学产品。

[1] 司龙龙, 李利军, 李永丽,等. 微生物基因组尺度代谢网络模型构建方法的比较分析[J]. 生物数学学报, 2018, 33(2):222-230.

[2] von Kamp, A. Klamt, S. Growth-coupled overproduction isfeasible for almost all metabolites in five major production organisms [J]. NatCommun, 2017,8(15956).