Pharmacological Research|中国中医科学院中药研究所|利用无监督机器学习对异质网络中化合物的细胞功能相似性进行人工智能方法的中药机理探索，以小儿消食颗粒为例

今天我们来学习2020年中国中医科学院中药研究所杨红军教授在Pharmacological Research上发表的“利用无监督机器学习对异质网络中化合物的细胞功能相似性进行人工智能方法的中药机理探索，以小儿消食颗粒为例”

摘要
“多向药理学”通常用于描述单一化合物的全网络效应，但中药根据 "多成分、多靶点、多通路 "的原则，自然具有多向药理学效应。研究多成分的中药的多药理机制是一个挑战。 在本研究中，我们以小儿消食片（XEFP）颗粒为例，描述了一种用于中药多向药理研究的无监督学习策略，并探讨了XEFP对多因素疾病功能性消化不良（FD）的多向药理机制。基于细胞功能指纹的相似性评价的化合物的无监督聚类显示，没有相似靶点和化学结构的中药化合物也可以对同一疾病产生相似的治疗效果，因为不同的靶点参与了与病理过程密切相关的同一通路。 在这项研究中，我们提出了一种无监督的机器学习策略来探索基于多向药理学的中药机制，利用基于细胞功能相似性的分层聚类，建立从化学聚类模块到细胞功能的联系。 同时，以FDA批准的防治FD的药物作为FD作用机制的参照物。首先，基于XEFP化合物和FDA批准的FD药物的细胞功能的相似性建立的化合物-化合物网络，中药的可能治疗功能可以代表FDA批准的药物的已知机制。 然后，作为无监督学习，基于细胞功能指纹相似性的中药化合物的分层聚类可以帮助将化合物分为几个具有相似治疗功能的模块，以研究中药的多向药理作用。 此外，整合中药和已批准药物的定量组学数据（来自LINCS数据集），为中药治疗功能与已批准药物的一致性提供了更多的定量证据。一个解痉实验证实了香草酸抑制平滑肌的活性；香草酸也被预测为XEFP的活性化合物，支持了我们策略的准确性。 综上所述，本研究提出的方法为研究中药的多向药理研究提供了一种新的无监督学习策略，即在化合物功能模块和药物激活的细胞过程之间建立与FDA批准的药物共享的联系，这可能会以FDA批准的药物为参考，阐明传统医学的独特机制，促进发现中药的潜在活性化合物，并为复杂疾病提供新的见解。

1. 引言
基于整个网络的信号传导效应，一个化合物可以抑制多个疾病相关的靶点，这被称为 “多向药理学”。具有多个靶点的化合物可能更有疗效，而且更不容易出现耐药性突变。由于生物网络固有的复杂性，阻断单一靶点可能无法有效关闭细胞通路，特别是对于多因素疾病而言。靶向药的 "脱靶"或 "非典型 "靶点使这些药物在其预定靶点之外显示出潜在的多药理学应用。最近对脱靶抗肿瘤药物的研究表明，这些脱靶的相互作用不是简单的药物的副作用，而经常是小分子药物阻止癌症生长的基本作用机制（MoA）。 这些发现表明，药物的预期靶标与其他蛋白相互作用，以关闭一个细胞过程，或者药物的 "非常规 "靶标阻止了非预期的通路，这显示了多向药理学对复杂疾病产生影响的潜力。在预定靶点之外，通路的指纹、ATC编码和治疗效果已被用于描述多向药理学研究中的药物治疗功能。

细胞功能指纹 "是一个类似于 "通路指纹 "的概念，它被提出来描述受中药影响的重要治疗功能的概况。 中药作为一种多成分的药物，根据’多成分、多靶点、多通路’的原则，自然具有多向药理作用。作为中草药，中药中的植物次生代谢产物在传统医学和民间使用中对缓解多种疾病发挥了重要的作用。基于次生代谢物相似的化学结构，可以推断出可能的协同作用或拮抗作用。 具有相似药理作用的化合物可能会与同一组靶点（即蛋白质家族）结合，从而发挥协同作用，对抗生物网络的冗余。此外，没有共同靶点的药物也可能对同一疾病产生类似的治疗效果，因为不同的靶点参与了同一通路，而该通路与病理过程密切相关。因此，一个被称为 "细胞功能指纹 "的概念被引入，以表明受化合物靶点影响的重要细胞过程的概况，这有助于进一步研究已知药物的潜在功能或新的潜在药物的未知功能。在本研究中，我们假设，由于各种组成成分，中药可能在一个以上的细胞过程中发挥协同作用。中医的兼容理论也支持这一假设。然而，如何客观地评价中药化合物在细胞过程中的协同作用？

作为一个针对多因素疾病的中医药例子，小儿消食颗粒（XEFP）是一个以神灵白术散为基础的中医药配方，是CFDA（中国食品药品监督管理局）批准的治疗儿童功能性消化不良（FD）的中医药。与大多数复杂的疾病类似，功能性消化不良的确切机制尚未完全阐明，似乎是多因素造成的。 饮食因素、胃排空和容纳功能受损、胃过敏、肠道微生物群、社会心理因素-脑肠轴（即压力、焦虑和抑郁症状）被认为在该病的病因中发挥了重要作用。还提出了其他建议的病因，包括十二指肠低度炎症、免疫激活和遗传易感性。XEFP可以缓解FD的症状，但没有彻底阐明机制。 与XEFP不同，有几种FDA批准的基于特定MoA的药物可以减轻FD的症状，包括质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂、5-HT3受体拮抗剂、5-HT4受体拮抗剂、多巴胺受体拮抗剂和神经调节剂/抗抑郁剂。

XEFP和FDA批准的具有确切作用机制的药物都可以缓解FD的症状。我们能否用FDA批准的药物作为FD代表性病理过程的金标准？是否可以评估中药与批准药物（金标准）之间的细胞功能相似性，以阐明中药的多向药理特征？ 因此，我们引入了一种新的计算策略，即基于 "生物功能相似性评价 "的中药化合物无监督分层聚类，并通过功能组学分析对其进行验证，以比较中药与已批准的药物，研究中药的化合物协同作用。 首先，根据化合物的生物功能与FDA批准的FD药物的相似性建立的化合物-化合物网络，根据FDA批准的药物的已知机制提出中药的可能治疗功能。然后，作为一种无监督学习，基于细胞功能指纹相似性的中药化合物的分层聚类可以帮助将化合物分为几个具有相似治疗功能的模块，以研究由于小的和未标记的样本导致的中药的多向药理学效应。 此外，整合中药和已批准药物的定量组学数据，为中药调节治疗功能与已批准药物的一致性提供了更坚实的定量证据。本研究提出的方法为中药的多向药理学研究提供了一种无监督的学习策略，这可能有助于以FDA批准的药物为参考，阐明传统药物的独特机制，并可能为复杂的疾病提供新的见解。此外，基于细胞功能指纹的中药化合物分类将中药的潜在活性化合物与表现出多向药理学特征的潜在活性联系起来。

2. 材料和方法
2.1 文献挖掘XEFP的组成化合物
XEFP是CFDA批准的药物，由6种药材组成，包括白术、陈皮、山楂、党参、莲子和茯苓。从中药数据库TCMSP和TCMID中检索到了XEFP的化合物成分库。对数据库中的化合物的信息进行了整理和重新组织。对不同数据库中具有相同化学结构的化合物进行了删减。从ChemSpider数据库（http://www. chemspider.com/）下载XEFP所有组成化合物的分子结构文件并以InChI格式保存。

2.2 XEFP的虚拟ADMET预测
对候选药物的体内ADMET（吸收/分布/代谢/毒性）进行计算预测，使我们能够筛选出具有潜在有利的药代动力学/药效学特性的可能的活性化合物。为此，XEFP的所有化合物都采取了admetSAR（v2.0）进行ADMET预测，它采用了大量的机器学习和QSPR（定量结构-活性关系）回归模型来预测特定化学结构最常见的ADMET端点。在这项研究中，对于一个给定的分子，其吸收特性（Caco-2：阳性和人类肠道吸收：阳性）、分布特性（血浆蛋白结合：[-1.6902,1. 28]）、代谢特性（对CYP1A2和CYP2C19的抑制：阴性，底物CYP2C9和CYP2D6：阴性，对OATP1B1的抑制：阳性）、排泄特性（水溶性小于-1）和毒性特性（急性口服毒性：I，II，III，致癌性：阴性）都用admetSAR进行预测，并根据上述筛选标准进行过滤。XEFP的分子经OpenBabel转换后作为SMILES字符串提交给服务器。

2.3 基于化学结构和全面靶标的药物相似性评价和分层聚类
两种药物之间的相似性从三个方面衡量，包括化学结构、综合靶标和细胞功能指纹。分层聚类法被用来揭示具有相似属性（包括化学结构和靶标）的药物集群。

化学结构的相似性是根据FP2 指纹和功能团。分子指纹以一系列二进制数字（比特）对分子结构进行编码，代表分子中特定子结构的存在或不存在。将指纹进行对比，将使我们能够确定两个分子之间的相似性，但指纹并没有包含完整的结构数据（如坐标）。一旦SMILES字符串被转换为标量指纹，Tanimoto系数被用作相似度分数，以衡量两个分子之间的绝对相似度。两种药物之间的靶点相似性是根据化合物的综合靶点来衡量的。 在本研究中，我们使用了3种靶点来测量药物与靶点的相互作用，这些靶点来自文献挖掘资源STITCH、Pubchem的化合物生物活性资源生物测定数据库和预测资源BATMAN-TCM。对于一个查询的化合物-靶标相互作用，我们使用综合得分作为最终预测得分。 综合得分是通过合并三种证据来源的概率来计算的，其计算方法如下所述：
P_stitch代表来自文献挖掘资源STITCH的药物-靶点相互作用的概率，P_bioassay代表来自Pubchem Bioassay的药物-靶点相互作用的概率，而P_batman代表来自BATMAN-TCM的概率。综合得分大于0.4的目标被认为是查询化合物的潜在综合靶标。

两个药物之间的靶点相似性是根据化合物的潜在综合靶点来衡量的。 例如，Ta代表药物a的综合靶点空间，Tb代表药物b的靶点空间，相似度得分S_a,b，计算如下。

给定一组需要聚类的N个化合物，生成一个N×N相似性矩阵，用R软件包hClust根据化学结构和综合靶点的相似性矩阵分别执行N个化合物的分层聚类。

2.4 基于细胞功能指纹的中药化合物和FDA批准药物的无监督聚类分析
无监督的机器学习技术直接从无标签的数据中学习分子特征的基本模式。作为无监督的算法，分层聚类算法被应用于将中药化合物与FDA批准的药物混合，并在高维空间中按预定的距离指标划分为几个子群。化合物的距离指标包括两种药物的细胞功能指纹相似度，该指标是基于PathSim方法的 "化合物-靶标-细胞功能 "异质网络测得的。 在 "化合物-靶标-细胞功能 "异质网络中，两个药物的元路径 "化合物-靶标-细胞功能-靶标-化合物 "被考虑用来描述两个药物之间的联系。在这个例子中，化合物的细胞功能指纹是用GO生物过程术语、靶标和化合物来描述的。 在metapath框架下，开发了PathSim来寻找网络中的同行对象（例如，寻找具有类似GO功能描述的药物），并根据metapaths来衡量同行对象的相似性。"化合物-靶点-细胞功能 "的异质网络由基因本体数据库[25]中的药物-综合靶点相互作用和靶点-细胞功能关系组成（只有生物过程，在2018.4.3下载）。为了消除两种药物靶点数量不平衡造成的偏差，我们开发了一种优化的PathSim算法，即只根据每种药物的50个靶点（从相应药物的靶点空间中随机挑选）计算两种药物的相似度分数。100个随机挑选后产生100个相似度分数，两个药物的最终相似度分数是平均分数。给定一组要聚类的N个化合物，生成一个×NN的相似性矩阵，根据细胞功能指纹的相似性矩阵，由R包hClust[22]执行N个化合物的分层聚类。

2.5 基于细胞功能指纹的化合物-化合物相似性网络构建和子网络提取
复合-化合物网络由功能指纹相似性分数大于70%的复合-化合物相互作用组成（通过z-score进行归一化相似性分数>=1）。功能性化合物模块被作为子网络从化合物-复合网络中提取出来。通过计算模块化来分析网络的群落结构，以确定群落子网络。具有紧密相互作用的子网络表明，具有类似细胞功能指纹的化合物被认为是具有类似生物功能的功能化合物模块。在 "化合物-靶点-生物功能 "异质网络的基础上，通过共享细胞功能提取同一模块中两个药物之间的元路径 “化合物1-靶点-细胞功能-靶点-化合物2”。每个模块的共享GO生物过程术语被用来表示可能受这些化合物影响的生物过程，并将用于药物治疗后基于定量全向分析的药物激活的细胞功能发现。

2.6 经XEFP治疗的FD大鼠的蛋白质组学研究
FD大鼠胃部的蛋白质组数据收集自Wei的研究[26]。对相关研究组之间的每项比较进行非配对统计分析，采用显著性分析方法学生T检验。与对照组样品相比，FD大鼠的差异表达蛋白（DEPs）的定义是：P值<=0.05，上调蛋白的折叠变化≥1.1，下调蛋白的折叠变化≤0.91，这被认为是显著的，并用于进一步研究。蛋白质表达的火山图是用ggplot2[27]生成的。差异表达蛋白的层次聚类由hClust软件包[22]生成。蛋白质组数据的功能注释聚类使用ClueGO[28]进行，并使用Cytoscape v3.4.0[29]进行可视化。

2.7 FDA批准的药物的LINCS基因表达数据集的数据采集和预处理
我们访问了LINCS[30,31]（Library of Integrated Network-based Cellular Signatures）的L1000基因表达数据集，这些数据集适用于FDA批准的药物。为了便于计算相似性和避免冗余，我们参考R包 “hgu133a.db”（2.14.0版），将每个探针的表达向量（维数=22,268；Affymetrix人类基因组U133A阵列）缩减为基因的表达向量（维数=12,494），即取每个基因的多个探针的中值。我们考虑了以下2种扰动类型：暴露于化学药物6小时；暴露于化学药物24小时；分析了以下10种选定的细胞类型。NPC（人类诱导多能干细胞衍生的神经祖细胞系）；HA1E（人类肾脏上皮的永生细胞系）；MCF7（人类乳腺癌细胞系）；A549和HCC515（两个人类非小细胞肺腺癌细胞系）。HT29（人结直肠腺癌细胞系）；HepG2（人肝细胞癌细胞系）；PC3（人前列腺腺癌细胞系）；VCaP（人转移性前列腺癌细胞系）；和A375（人恶性黑色素瘤细胞系）。只有标记为 "地标 "的转录本被考虑在内，以计算化学药物扰动所引起的扰动相关的表达变化。向量a代表基因G在暴露于化学药物6小时的n种不同细胞类型中的转录组定量表达，向量b代表基因G在暴露于化学药物24小时的相应n种不同细胞类型中的转录组定量表达。矢量a和矢量b的spearman相关系数用来描述基因G在化学药物暴露6小时至24小时后的表达变化。Rho（ρ）大于0.4且统计学意义显著，表明基因G在化学药物暴露后被上调，小于-0.4则在化学药物暴露后下调。

2.8 发现药物治疗后激活的细胞功能
根据差异表达数据分析，药物治疗后活跃的细胞功能被定义为包括某些过程中富集的DEGs的基因集。如果一个细胞功能中的大多数基因都有明显的上调，这个细胞功能就被认为是一个活跃的过程（上调）。对于XEFP，药物激活的细胞功能被定义为那些在XEFP处理后差异表达蛋白明显富集的细胞功能（超几何检验，P值<=0.05），以XEFP的所有差异表达蛋白作为背景。对于被批准的药物，药物激活的细胞功能被定义为那些在被批准的药物治疗后有明显富集的差异表达的基因（超几何检验，P值<=0.05），使用被批准的药物的所有差异表达基因作为背景。

2.9 痉挛活性实验
四只雄性SD大鼠体重（200g-250g）禁食24小时，然后用1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉。迅速切除幽门附近的十二指肠段（10厘米），并在冰冷的KH缓冲液（NaCl 118.96 mmol / L; KCl 4.73 mmol / L; KH2PO4 1.17 mmol / L; MgSO4 1.17 mmol / L; NaHCO3 25.0 mmol / L; CalCl2 2.54 mmol / L; Glucose 11.1 mmol / L）中保持。用细镊子轻轻地将粘膜和粘膜下层去除。接下来，将十二指肠肌条切成长度约为1厘米的段（管），以测试对肠道平滑肌收缩力的影响。肠肌条悬浮在含有37 °C克雷伯溶液（含95% O2和5% CO2）的20 mL小室中，平衡30分钟，每15分钟更换一次浴液。在静止张力为1g的情况下平衡30分钟后，用连接到力位移传感器的BiopacMP150多用途测绘记录仪对十二指肠条纹进行等距测量。肠道平滑肌被乙酰胆碱刺激到高原期。在这一时刻，张力被记录为Emax。随后，分别以累积方式（10 mL、20 mL、50 mL、100 mL）在系统中加入香草酸和西甲丁，然后重新记录力量变化。每种药物的一个浓度干预6分钟后，计算力变化的平均值，然后开始下一次干预。实验结果是由至少三个数据进行的。

3 结果
3.1 XEFP活性化合物的ADMET虚拟筛选
首先，从中药数据库TCMSP[11]和TCMID[12]中收集XEFP的化学成分。此外，采用UPLC-LTQ-Orbi-trap-MS分析XEFP的化学成分[32]。在以前的研究中，在XEFP中分离并鉴定了一些化合物，包括31种黄酮类化合物、8种糖苷、6种生物碱、12种酚酸及其酯类、7种三萜类和20种其他化合物[32]。综合文献挖掘和UPLC-LTQ-Orbitrap-MS方法对XEFP进行全面的化学成分分析，为物质基础和进一步研究提供科学理论依据。结果，从6种药材的XEFP中收集了159个化合物。然后，利用admetSAR[13]对XEFP化合物的药代动力学特性进行了计算评估，筛选出可能的具有良好吸水性和低毒性的XEFP活性化合物。结果总结在表1中。根据预测的毒性、吸收和代谢特性，利用在线平台ad-metSAR中实施的不同化学信息学工具，选择了最有希望的候选化合物（129个），提供ADMET终点的综合预测。这些候选药物更有可能产生良好的效果，而ADMET筛选有助于我们确定可吸收的化合物，这些化合物比不可吸收的化合物更有可能产生效果。
3.2 基于无监督的分层聚类，XEFP具有与FDA批准的抗FD药物相似的细胞功能指纹
我们选择了23种FDA批准的药物，代表了6种具有不同MoA的治疗FD的药物，包括H2受体拮抗剂（西咪替丁、法莫替丁和奥美拉唑）、毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂（阿托品和泰伦泽平）、5-HT3受体拮抗剂（阿洛司琼、西兰司琼、格拉尼司琼、昂丹司琼、托吡司琼）、5-HT4受体拮抗剂（莫沙必利、普鲁卡必利、泰格塞隆）。Ramosetron和Tropisetron），5-HT4受体拮抗剂（Mosapride、Prucalopride、Tegaserod和Zacopride），多巴胺受体拮抗剂（Domperidone、Cisapride和Chlorpromazine），以及神经调节剂/抗抑郁剂（Amitriptyline、Doxepin、Fluoxetine、Mianserin和Venlafaxine）。经过虚拟ADMET过滤，我们建立了一个由129个XEFP类药物化合物组成的化合物库，并以23个FDA认证的药物作为FD的金标准参考。根据化学结构、综合靶点和细胞功能指纹的相似性，将XEFP的化合物与金标准进行比较。利用化合物的层次聚类来显示库中152个化合物的距离和分组，包括129个XEFP的化合物和6种FDA批准的药物。

首先，研究了XEFP化合物与6种FD药物之间的化学结构相似性。根据结构相似性对化合物进行分层聚类，发现化学结构相似的XEFP化合物基本聚在一起（图1A和S1A），而具有相同MoA的FD相关药物则聚在一起。例如，5-HT3受体拮抗剂（Alosetron、Ramosetron、Cilansetron和Ondansetron）因其化学结构和官能团相似而相互聚类。然而，XEFP的活性化合物没有与23种与FD相关的获批药物聚类，这表明XEFP化合物与治疗FD的金标准药物没有相似的结构或功能组。全面的靶点-化合物相互作用反映了化合物的潜在直接和间接靶点（表2）。基于靶点相似性的化合物层次聚类显示，与FD相关的批准药物没有与大多数XEFP化合物聚类，这表明XEFP化合物没有与批准药物相同的靶点（图1B和S1B）。

通过优化的Pathsim算法[24]，使用 "化合物-靶点-细胞功能 "的异质网络来评估化合物之间的功能指纹相似度。基于功能指纹相似性的化合物无监督层次聚类显示，XEFP化合物与已批准的药物聚类为9个亚群（图1C）。XEFP化合物的1-6个亚群也与已批准的药物聚类；例如，来自党参的N-壬醇与5-HT3拮抗剂在亚群4中聚类。然而，子群7-9只包含来自XEFP的化合物。XEFP化合物与已批准的FD药物有相似的生物逻辑功能（图1C）。不同的化合物与不同类型的FD药物聚集在一起，这表明XEFP可能对FD有不同的药理作用。作为无监督学习，基于相似性的中药化合物的分层聚类有助于将化合物分为具有类似治疗功能的几个模块，以研究中药的多药理作用。

对129个XEFP化合物和23个FDA批准的药物进行层次聚类表明，XEFP与FD药物有相似的细胞功能，但没有相似的化学结构和靶点。在XEFP化合物中，16%与已批准的药物基于化学结构相似性聚类，23%与已批准的药物基于靶标相似性聚类，37%与已批准的药物基于细胞功能相似性聚类。这一结果支持了我们的假设，即中药化合物可能根据或生通路物功能而协同作用。

3.3. 基于功能相似性的化合物-化合物网络来检索XEFP的功能化合物模块
基于细胞功能指纹的相似性，XEFP化合物与已批准药物进行了聚类。生物功能特征可以表明XEFP化合物与已批准药物之间具有不同的MoA的治疗互动。在这项研究中，我们建立了一个化合物-化合物网络，旨在研究具有类似功能指纹的药物的生物功能，其中包含1344个化合物-化合物对，涉及129个XEFP化合物和23个FDA批准的药物。在这个网络中，由于功能相似度高（归一化相似度得分>=1），化合物被连接起来。可以推断，聚类的药物和XEFP化合物在调节类似的生物过程的基础上倾向于发挥类似的治疗功能。以FDA批准的药物为标准，37%的XEFP化合物与这些批准的药物有联系，这表明XEFP化合物的潜在治疗功能与批准的抗FD药物相同（图2A）。

根据网络和化合物的拓扑特征，化合物-化合物网络可以分为几个子网络，其中的化合物具有相似的细胞功能指纹。一个子网络由具有类似治疗功能的化合物组成。每个子网络的化合物可能是一个具有独特MoA的针对FD的功能模块。为了探索不同集群的独特治疗功能，根据之前的分层聚类结果，将整个网络聚类为9个子网络（图2B）。子网1-6中的XEFP化合物因其相似的疾病生物学过程而与FD批准的药物聚集在一起，具有不同的MoAs。在模块3中，1-己醇与乙酰胆碱受体拮抗剂（替伦泽平、阿托品）聚类。已发现1-己醇能与胆碱能受体结合，阻断乙酰胆碱在骨骼神经肌肉接头处的突触传递作用[33]。

在模块2中，香兰素与抗抑郁药（如多塞平和氟苯尼考）聚集在一起。受一些研究的启发，香兰素确实通过提升大脑中的5-羟色胺和多巴胺水平而具有抗抑郁的活性[34-36]。这些结果意味着，基于细胞功能指纹的药物相似性评价可能有效地找到与已批准药物相似的MoAs的新化合物。

3.4. 功能性蛋白质组学显示，XEFP可以通过各种细胞功能缓解FD的症状
作为CFDA批准的治疗儿童FD的药物，XEFP被发现可以通过提高血液中淀粉酶和胃泌素的水平，同时降低NOS和乳酸来缓解FD大鼠的症状[26]。XEFP还可以显著降低血液中VIP、CGRP、IL-4和IFN-γ的数量[26]。为了探索XEFP对抗FD的机制，我们进一步研究了FD大鼠胃的蛋白质组以及用XEFP扰动后观察到的蛋白质组。总共鉴定了4407个蛋白质，其中341个蛋白质上调，457个蛋白质下调，在FD大鼠中（图3A）。在XEFP处理后，288个蛋白被上调，307个蛋白被下调（图3A）。层次聚类热图显示，大剂量XEFP治疗扭转了FD大鼠细胞-细胞粘附的下调，并通过抑制线粒体电子运输、TCA循环（三羧酸循环）和脂肪酸β-氧化，恢复了能量平衡（图3B）。差异表达蛋白的Gene Ontology聚类网络显示，FD大鼠中与细胞粘附和内质网功能相关的生物过程被下调，而肌动蛋白交联形成和肌肉收缩被上调（图3C）。XEFP治疗后，肌动蛋白丝和能量代谢，包括脂肪酸β-氧化、TCA循环和ATP生物合成受到抑制，而MAPK级联、细胞周期和对TNF的反应被激活（图3D）。总之，XEFP通过与细胞粘附、能量平衡和肌动蛋白相关的细胞骨架功能有关的多个生物过程，缓解了各种表型大鼠的FD症状。

3.5. 通过LINCS数据的功能全局分析，XEFP的化合物模块与FDA批准的药物具有相似的药物激活细胞功能
为了确定每个功能化合物模块的具体细胞功能，对同一模块中的XEFP化合物和FDA批准的药物提取了异质网络的共享元路径 “化合物-目标-细胞功能-目标-药物”。基于这些来自异质网络的元路径，发现特定的细胞功能代表了每个功能化合物模块与FDA批准的药物共享的独特功能。对于功能化合物模块1-6，有几个已批准的药物与XEFP的化合物共享类似的功能。XEFP化合物与已获批准的药物之间的功能相似性调查显示，MoAs在已研究的药物和化合物之间的联系值得进一步研究。中药的化合物可能与已批准的药物有类似的抗FD机制。幸运的是，XEFP治疗FD大鼠模型的蛋白质组数据已被调查[26]。来自LINCS数据库的转录组检测也提供了一个在全知层面探索已批准药物MoA的机会。在本研究中，根据omics数据（材料和方法），使用药物激活的细胞功能来研究XEFP和批准药物之间MoA的相似性。根据药物处理后XEFP和FDA批准的药物之间的表达趋势，对药物激活的细胞功能进行比较，发现XEFP化合物与FDA药物有相似的MoA，对FD显示出不同的MoA，表现出XEFP的多药理学效应。

对于每个功能化合物模块，我们重点研究了XEFP和FDA批准的药物之间共享的细胞功能。同时，药物治疗后共享细胞功能的靶点的表达变化为确定药物激活的细胞功能提供证据。以模块1为例，XEFP和5-HT3受体拮抗剂靶点参与了肌动蛋白细胞骨架组织、胆碱能突触传递、肌肉细丝和胶原纤维组织等过程。根据XEFP的蛋白质组数据和5-HT3受体拮抗剂的LINCS转录组检测的表达数据，XEFP和5-HT3受体拮抗剂处理后有少数基因共同表达，但这些细胞功能中的大多数靶点在XEFP处理后被上调，根据批准药物处理的细胞系转录组检测，5-HT3受体拮抗剂的靶点在同一过程中也被上调（图4）。肌动蛋白细胞骨架已被证明与FD的屏障功能异常密切相关[37,38]。Gill等人发现5-HT通过5-HT3/4受体亚型减少肌动蛋白细胞骨架的重组[39,40]，与5-HT3受体拮抗剂上调肌动蛋白细胞骨架组织过程的发现一致。在细胞过程层面，XEFP和获批药物调节了类似的生物功能，甚至核心化了这些过程，而在靶点层面则不太一致。这一结果表明，功能指纹可能更适合研究药物之间的相似性。

XEFP和FDA批准的药物具有相同的药物激活的细胞功能，正如预期的那样，但不是特定的基因/蛋白质。这种现象也出现在其他五个功能化合物模块中。对于模块2，XEFP下调了与多巴胺反应有关的过程，与多巴胺受体拮抗剂和抗抑郁药类似。与B细胞和T细胞有关的免疫激活生物过程被XEFP、H2受体拮抗剂和乙酰胆碱受体拮抗剂所上调。在模块4中，与脂肪酸代谢和葡萄糖运输有关的能量平衡被XEFP和5-HT4受体拮抗剂（Zacopride）下调。在模块5和模块6中，平滑肌收缩受到XEFP和5-HT4受体拮抗剂（模块5中的Mosapride和模块6中的Tegaserod和Prucalopride）的核心调节。所有这些细胞功能都被证明在FD中起着重要的作用，而且XEFP与FDA批准的防治FD的药物显示出类似的调节趋势。这些结果表明，XEFP与临床上用于治疗FD的药物具有相似的MoA，并且具有多药理学特征，可以在许多方面治疗FD。为了建立化合物和疾病之间的联系，我们提供了化合物-功能-疾病网络来证明化合物和疾病之间的关系（图4B）。与功能性消化不良相关的疾病表型是从人类表型本体数据库中提取的，包括胃肠道功能异常（HP:0012719）、Ab-正常胃肠道运动（HP:0030895）、胃肠道炎症（HP:0004386）、胃肠道梗阻（HP:0004796）和胃肠道的反复感染（HP:0004798）。结果显示，模块3专门与胃肠道炎症有关，模块4和模块5专门与胃肠道运动异常有关。而模块1、模块2和模块6都与胃肠道的疾病表型功能异常有关。这些结果表明，基于细胞功能相似性的复合模块与特定的细胞功能和特定的疾病表型有关。

3.6. 基于性能预测的文献挖掘和痉挛活性实验的实验验证
在sTable3中列出了XEFP最可能的活性化合物（包括XEFP中的34个化合物），并根据细胞功能指纹的相似度得分对化合物-药物关系进行排序。为了验证基于细胞功能指纹相似性的预测的准确性，从文献中挖掘了可能的活性化合物的药效学实验。在34个可能的活性化合物中，有12个被证实具有FD相关的药理作用（表1），这表明本研究的预测策略具有良好的预测性能。在表1中，大多数化合物可以调节胃肠道的蠕动和炎症，以改善FD的症状。表1还提供了经文献验证的XEFP可能的活性化合物的化学结构、分子式、药理作用。

为了验证预测性能，我们用平滑肌的解痉活性实验来测量XEFP化合物的活性（以模块3的香草酸为例）。痉挛活性实验用于测量药物对平滑肌松弛的影响，特别是在胃肠道的管状器官，包括胃和肠道。而平滑肌收缩（模块3,5,6）是受XEFP调节的一个重要生物过程。在模块3中，香草酸与FDA批准的药物西咪替丁的相似度比较高（表3）。因此，模块3中的香草酸被选为一个例子，西米替丁被选为金标准参考。如图5所示，香草酸（0.23、0.67、1.81、4.97μM）对ACh浓度-反应曲线有明显的抑制作用，从而降低了最大诱导收缩，对0.6mM ACh的反应分别造成23 %、36 %、44 %和47.4 %的降低。西米替丁具有类似的解痉活性。香草酸明显抑制了平滑肌收缩，也抑制了西米替丁，这证实了香草酸预示着对平滑肌收缩的作用与FDA批准的药物相似。

4 讨论和结论
本研究提出了基于功能指纹的化合物相似性，通过与FDA批准的抗FD药物的比较，研究中药配方-XEFP颗粒的多药性。本研究首次基于生物功能和通路而非靶点或化学结构来阐明中药的机制。基于功能指纹相似性的无监督层次聚类，XEFP化合物聚类为9个化合物模块，其中6个与FDA批准的药物有相似的功能指纹。然而，基于化合物的目标和化学结构的相似性评价并没有使XEFP化合物很好地聚类，而是使它们相互分离。此外，事实证明，XEFP化合物和获批药物共享的相似功能在XEFP和获批药物治疗后也会发生变化。根据XEFP化合物和FDA批准的药物的无监督聚类，预测XEFP中的香兰素具有抗抑郁活性（与抗抑郁药聚类），1-己醇被预测为阻止乙酰胆碱突触传递的作用（与乙酰胆碱受体拮抗剂聚类）。香兰素和1-己醇都已被证实具有上述活性[33-36]。所有这些结果表明，基于通过异质网络对功能指纹进行分层聚类的无监督学习是一种有效的方法，以FDA批准的药物作为金标准参考来预测化合物对疾病的MoA。

根据实验和文献证据，基于细胞功能指纹的相似性，对活性化合物的预测是有效的。这里我们用香草酸、α-蒎烯和β-蒎烯作为例证。根据模块3中的细胞功能指纹，香草酸与西米替丁相似。"化合物-靶点-功能 "网络显示，香草酸和西米替丁有共同的靶点，这些靶点与平滑肌功能有关，香草酸也有与平滑肌功能有关的独特靶点TNF（图6A）。痉挛活性实验验证了预测结果，即香草酸与FDA批准的药物西米替丁对平滑肌收缩有类似的作用。"化合物-目标-功能 "网络显示，除PPARG和HPGD外，α-蒎烯、β-蒎烯和tegaserod都有独特的目标参与平滑肌功能（图6B）。作为陈皮中的萜类，α-蒎烯和β-蒎烯被报道对平滑肌有松弛作用[57]。所有这些结果表明，基于异质网络的细胞功能指纹的分层聚类的无监督学习是一种有效的方法，以FDA批准的药物作为黄金标准参考来预测化合物的抗病作用。在34个可能的活性化合物中，有12个被证实具有FD相关的药理作用（表1），这也表明本研究的预测策略具有良好的预测性能。这种方法也能有效地找到潜在的XEFP的活性化合物，这些化合物仅根据目标相似性就会被忽略。本研究提出了基于功能指纹的化合物相似性，通过与FDA批准的针对FD的药物进行比较，研究中药配方-XEFP颗粒的多药性。这是首次基于生物功能和途径，而不是基于靶点或化学结构来阐明中药的机制。

使用与疾病相关的FDA批准的药物作为参考，可以将中药的化合物与参考进行比较，以发现它们对疾病的潜在MoA。然而，多成分和各种药性使我们很难说明XEFP对FD的影响。更重要的是，FD的确切机制似乎是多因素的，这增加了其复杂性。作为一种多因素的疾病，有不同类型的药物，有不同的MoA来治疗FD。比较XEFP与不同MoA药物的功能相似性，有助于探索中医药治疗复杂疾病的多药理特点。在本研究中，基于化合物和FDA批准的药物（作为黄金参考）的细胞功能相似性的无监督学习策略为多种化合物药物，特别是中药的多药理学研究勾勒出一个更有说服力的方法。基于这种方法，通过omics大数据预测和验证的XEFP具有以下活性。抗抑郁（抗抑郁药）、阻断多巴胺受体（5-HT4受体拮抗剂）、细胞粘附相关的细胞骨架组织（5-HT4受体拮抗剂）、T细胞和B细胞的免疫调节（H2受体拮抗剂）、平滑肌收缩（5-HT4受体拮抗剂），以及能量平衡，包括脂肪酸和葡萄糖代谢（5-HT4受体拮抗剂）。

此外，功能模块1-6中的XEFP化合物与共享药物激活的细胞功能之间的联系为潜在的活性化合物对抗FD提供了线索。据预测，模块1-6中的化合物参与了与十二指肠粘膜完整性有关的细胞粘附力的异常表达[63]、平滑肌收缩力的改变[64]和能量代谢的紊乱[65]，这与重要的功能性胃肠道疾病（FGIDs）的病理生理学有关，如FD。模块5和模块6中的两种化合物在调节平滑肌收缩方面都表现出活性，平滑肌收缩是FD的重要病理生理过程，受XEFP化合物数量最多的调节。特别是在模块6中，作为陈皮中的萜类化合物，α-蒎烯和β-蒎烯[57]被报道对平滑肌有松弛作用，这为我们的预测策略提供了更多验证证据。这一现象也表明，模块6中的其他化合物可能具有调节平滑肌收缩的潜力。XEFP可能为基于指纹相似度聚类的药物组合提供线索。在图2中，我们发现5-HT4受体拮抗剂和乙酰胆碱受体拮抗剂/H2受体拮抗剂/多巴胺受体拮抗剂之间的药物组合可以覆盖XEFP中大部分化合物的作用，这可能提供一个新的治疗FD的方案。Cho KH等发现马来酸曲美布汀和莫沙必利联合治疗FD很有效[66]，其中前者是乙酰胆碱受体拮抗剂，后者是5-HT4受体拮抗剂。

除了六个功能化合物模块（模块1-6），三个模块（模块7-9）与任何已批准的抗FD药物没有相似的生物过程。这一发现的可能原因是这些化合物对XEFP是多余的，这是中医的一个偶然现象。此外，这些化合物可能与其他未显示出对FD作用的药物有类似的MoA，或包括在我们的研究中，这将为发现更多复杂疾病的可能机制提供线索。

这项研究也有几个局限性。首先，无监督学习方法适用于这种小型和无标签的XEFP数据。然而，在进一步的研究中，应该考虑用监督学习方法来预测化学成分与潜在的细胞功能之间的联系，并发现化学成分与细胞功能之间的联系。和潜在的细胞功能之间的联系，并更准确地发现中药和天然产品中的活性成分。第二，化学成分的细胞功能指纹只根据基因本体论注释来描述。KEGG通路、Reactome通路和ATC编码应该参与进来，从不同角度描述药物的细胞功能指纹。第三，与omics大数据的整合对多药理学研究很重要。Guo等人基于其多药理学框架[67]讨论了小檗碱对三种不同类型癌症的影响和MoAs，该框架整合了天然产物的多药理学和大规模癌症基因组学数据。这个框架对开发针对肿瘤生态系统的药物组合很有希望[68]。中医研究应该利用全息图谱大数据的优势来支持多药理学研究。

综上所述，本研究提出的方法通过建立与FDA批准药物共享的化合物功能模块和药物激活的细胞过程之间的联系，为有关中药的多药理学研究提供了一种新的无监督学习策略（图7），这可能有助于以FDA批准的药物为参考，阐明传统医药的独特机制，并可能为复杂疾病提供新的见解。