大肠杆菌转化

大肠杆菌转化是指将外源DNA分子导入大肠杆菌受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。

一、转化原理

在自然条件下，质粒等DNA分子可通过细菌接合作用转移到新的宿主内。然而，在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。为了将质粒载体转移进受体细菌，需要诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

二、转化步骤

1. 制备感受态细胞

   • 挑选合适的菌种接种到适当的培养基中，进行培养。通常选择对数生长期的细胞，因为此时细胞代谢活跃，细胞膜的通透性也相对较高，有利于外源DNA的进入。
   • 使用化学试剂（如氯化钙CaCl₂）处理大肠杆菌细胞，使其形成感受态。这些试剂能改变细胞膜的通透性，让细胞更容易接纳外源DNA。
   • 注意事项：操作过程需要在冰浴低温下进行，防止感受态细胞受杂菌污染。制备感受态细胞的培养基和试剂要保证纯度，避免杂质影响转化率。在制备感受态细胞过程中，离心管不要摇动，防止细胞破裂。

2. DNA转化

   • 将目的DNA分子与致敏缓冲液混合，加入到感受态细胞中，进行转化。
   • 在42℃下短暂热处理（如90秒），使细胞膜的通透性发生改变，为DNA分子提供进入细胞的通道。
   • 注意事项：热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确。同时注意热处理过程中离心管不要摇动。

3. 复苏培养

   • 热处理后，迅速将混合液转移到冰上冷却。
   • 加入适量的培养液（如2YT培养液），在适宜温度（如37℃）下慢速摇床培养一段时间（如1小时），使细胞恢复生长状态。

4. 筛选与鉴定

   • 将复苏培养后的菌液涂布到含有适当抗生素的平板培养基上。
   • 在适宜的温度和湿度下培养一段时间（如12~16小时），观察菌落生长情况。
   • 通过菌落形态、颜色等特征初步筛选转化成功的细胞。
   • 进一步可通过PCR、酶切等方法鉴定外源DNA是否成功整合到细胞基因组中。

三、常用方法

除了上述传统的氯化钙法外，还有电穿孔法、噬菌体感染法等其他方法可用于大肠杆菌的转化。这些方法各有优缺点，选择时需根据实验需求、细胞类型及DNA大小等因素综合考虑。

四、注意事项

1. 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿如离心管、tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理；所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染。
2. 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA），且其浓度和外源DNA的量在一定范围内与转化效率成正比，但过多或过大的DNA量会降低转化效率。
3. 感受态细胞制备和转化过程中要注意保持低温条件，以防止细胞破裂和DNA降解。

大肠杆菌转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。通过合理的实验设计和操作技巧，可以高效地将外源DNA导入大肠杆菌受体细胞并实现遗传信息的转移。