细胞核荧光探针：一种红色发光、NADPH响应的的喹啉基荧光探针

参考文献：Download Citations | ACS Publications

一、研究背景：

        NADPH是一种重要的氢供体和电子载体，参与了许多生物过程。该探针通过克恼文格尔反应嫁接了一个氰基吡啶基团，通过喹啉上的甲基正离子和NADPH之间发生ICT电子转移效应，实现探针的激发和NADPH对探针的还原。允许探针开启红色响应并且具有12nM超低检测限。

二、常见的NADPH识别单元：

参考文献： 细胞抗氧化剂荧光探针的最新进展：NADH、hNQO1、H2S和其他氧化还原生物分子的检测 - ScienceDirect

1.基于硼酸酯和刃天青的NADPH识别单元设计：

         在硼酸酯和刃天青结合的荧光探针，通过硼酸酯对NADH的锁定和NADH上的氢作用于氮氧离子的部分，实现刃天青的部分在575nm处发射近红外的荧光增强（黄光的发射波长为580~595nm，近红光是650~900nm）。再通过硼酸酯的水解实现对NADH的释放。

2.基于吡啶和喹啉的NADH探针的设计： 

         Konig和同事提出了利用特异性花青类似物，在不同缺电子杂环受体下进行NAD(P)H介导的氧化还原反应。由喹啉、吡啶、异喹啉、噻吩阳离子和半花青类似物的结合中形成双受体的探针，在NADH的还原下形成D-A型探针，在561nm处对NAD(P)H相较于类似物荧光强度增长30倍。

三、探针的设计思路： 

 1.使用氰基吡啶来替换上面konig的半花青类似物的受体作用：

         使用NADH来还原探针，实现探针从双受体到D-A型探针的转变。设计NADH-R可以将探针从D-A型转变为D-Π-A型。①通过延长供体和受体之间的双键，实现探针向红光的转变。②通过氰基吡啶中的氰基，降低多甲基链的电子密度，降低了其与单线态氧负离子的反应性。③吡啶盐可以提高探针的水溶性，通过与线粒体内膜的负电性相互作用实现对线粒体的靶向性。

        上述的NADH-G和NADH-R对NADPH均具有良好的选择性和敏感性，但后者荧光强度（NADH-R相较于NADH-G强度增长了335倍），所以后续继续使用NADH-G进行后续实验。 

四、实验讨论： 

 1.光谱实验：

     1.1紫外吸收光谱（图表A）：

        通过在37℃中PBS下NADH的添加的紫外吸收峰可显示，添加NADH后在近红外区域有明显的吸收峰。

     1.2荧光吸收光谱（图表B）：

        荧光，是指一种光致发光的冷发光现象。荧光材料在接收高能量（短波长）光子的能量后，部分能量以热的形式耗散掉，而另外一部分能量，则转换为低能量（长波长）的光子，产生荧光。

        荧光材料在未接收光子能量前，分子处在基态轨道（S0）。在接收一光子能量后（hvA），分子内发生电子跃迁，重排，经振动弛豫后（内转换过程），分子处于第一激发态单重态（S1）。处在第一激发态单重态的分子是不稳定的，最终会回到基态轨道，并将能量以光子的形式释放出去（hvF），产生荧光。 

        前些年通过对DNA的荧光激发，利用DNA两端的供体和受体结构，实现FERT电子转移，同理在图表B中利用NADH的刺激，由受体-受体结构转变为供体-受体结构，从而促进荧光材料在分子内发生由受体到供体的电子跃迁，产生与对照相比335倍的荧光强度。

        1.3 时间依赖曲线光谱（图表C）：

          时间依赖曲线光谱表示荧光探针随着时间对响应物的荧光强度，可以观察到随着时间的不断增加（增加到45mins）荧光强度达到最大，说明在45mins时，在25 μM的NADH对荧光探针的转化基本完成。

        1.4  浓度依赖曲线光谱（图表D）：

          浓度依赖曲线光谱表示在不同浓度响应物(NADH)下探针荧光强度的变化， 随着浓度的提高（从0μM到35μM），荧光强度不断增强，且荧光强度随浓度呈=0.9875线性相关。

       1.5  不同生物标记物的响应强度（图表E） ：

          在各种分析物存在下，5 μM NADH-R在657nm处的荧光强度。其中在最后两列中分别使用NADPH、NADH，相较于其他生物响应物，均具有明显的荧光强度。

        1.6  梯度PH条件下的荧光强度（图表F）：

        体内存在不同PH浓度的组织和器官，通过梯度PH条件下的有无生物特征物的荧光强度进行比较，可以看出该探针在不同PH条件下具有较强的适用性。

2.细胞成像实验：