宏基因组中的病毒组分析（2）checkV评估病毒基因组的质量

得到病毒contig后（具体方法查看以往文章，宏基因组中的病毒组分析（1）病毒序列的鉴定geNomad-CSDN博客）使用 CheckV 进一步处理预测的病毒序列，以评估病毒基因组的质量。

1、工作原理

CheckV 是一个完全自动化的命令行工具，主要用于评估单重叠群（contig）病毒基因组的质量，包括识别整合原病毒中的宿主污染、估计基因组片段的完整性以及识别封闭基因组。其工作原理可以概括为以下几个主要步骤：

1. 去除宿主污染：
   • CheckV 首先通过与自定义的隐马尔可夫模型（HMM）数据库进行比较，将基因注释为病毒或细菌。
   • 接着，它扫描重叠群（从5'到3'），比较相邻开放阅读框（ORF）之间的基因注释和GC含量，以计算每个基因间位置的分数，并识别宿主-病毒断点。
   • 通过高分（>1.2）和特定基因数量（如宿主区域中至少2个宿主特异性基因，病毒区域中至少2个病毒特异性基因）来判定并去除宿主污染。
2. 估计基因组完整性：
   • CheckV 使用两种算法来估计基因组的完整性：基于平均氨基酸同一性（AAI）的方法和基于HMM的方法。
   • AAI 方法通过将蛋白质与CheckV基因组数据库中的参考基因组进行比较，计算重叠群长度与匹配的参考基因组长度之间的比率来估计完整性。
   • HMM 方法则识别重叠群上的病毒HMM，并与共享相同HMM的参考基因组长度进行比较，给出完整性的估计范围。
3. 预测封闭基因组：
   • CheckV 通过识别直接末端重复（DTR）、原噬菌体（原病毒）边界和反向末端重复（ITR）等特征来预测封闭基因组。
   • 这些特征如DTR（在contig的开始/结束处重复序列>20-bp）和ITR（在contig的起始/末端重复>20-bp的序列，但3'重复被倒置）用于确认环状或线性基因组的完整性。
4. 总结质量：
   • 根据上述步骤的结果，CheckV 生成报告文件，并将查询重叠群分配到五个质量层之一（如完整、高质量、中等质量、低质量和质量未定）。

2、运行命令

 执行以下命令安装 CheckV，下载数据库，然后运行程序：

conda install -c conda-forge -c bioconda checkv
checkv download_database ./
export CHECKVDB=</path/to/database>
checkv end_to_end <input_file.fna> output_directory -t 16

2.1 安装

安装CheckV有三种方法：conda，pip或者docker，此处介绍conda的方法

#官方推荐
conda install -c conda-forge -c bioconda checkv=1.0.1
#我个人在使用过程中，conda无法安装，只能使用mamba安装
mamba install  checkv=1.0.1

checkV还需要安装数据库，可以利用conda安装或者手动安装：

conda安装

checkv download_database ./

手动安装

wget https://portal.nersc.gov/CheckV/checkv-db-v1.0.tar.gz
tar zxvf checkv-db-v1.0.tar.gz
#也可以指定数据库的位置
export CHECKVDB=/path/to/checkv-db-v1.0

2.2运行

checkv end_to_end <input> <output> [options]

可以使用  checkv end_to_end -h 查看参数使用：

positional arguments:
  input         以FASTA格式输入核苷酸序列（支持.gz，.bz2和.xz文件）
  output        输出目录
 
optional arguments:
  -h, --help    显示此帮助消息并退出
  -d PATH       引用数据库路径。默认情况下，使用 CHECKVDB 环境变量【添加后可不写】
  --remove_tmp  从输出目录中删除中间文件
  -t INT        用于Prodigal和DIAMOND的线程数
  --restart     覆盖现有的中间文件。默认情况下，CheckV 在程序中断的地方继续
  --quiet       禁止记录消息
  
programs:
    end_to_end          运行完整的管道以估计完整性，污染并识别封闭的基因组
    contamination       识别并消除集成前病毒上的宿主污染
    completeness        估计基因组片段的完整性
    complete_genomes    根据末端重复序列和侧翼宿主区域识别完整基因组
    quality_summary     跨模块汇总结果
    download_database   下载最新版本的CheckV数据库

checkV也支持分步使用：

checkv contamination input_file.fna output_directory -t 16
checkv completeness input_file.fna output_directory -t 16
checkv complete_genomes input_file.fna output_directory
checkv quality_summary input_file.fna output_directory

3、结果文件

quality_summary.tsv是来自三个主要模块的集成结果，是需要查看的主要文件。

文件包括：contig_id、contig_length、provirus、proviral_length、gene_count 、viral_genes、host_genes、checkv_quality、miuvig_quality  、completeness、completeness_method、complete_genome_type、contamination、kmer_freq和warnings。

可以根据文献或者自己的实验情况选择相应的标准对病毒序列进行筛选，例如在这篇文章中，作者就采取了以下规则选择病毒基因组：A global atlas of soil viruses reveals unexplored biodiversity and potential biogeochemical impacts | Nature MicrobiologyHistorically neglected by microbial ecologists, soil viruses are now thought to be critical to global biogeochemical cycles. However, our understanding of their global distribution, activities and interactions with the soil microbiome remains limited. Here we present the Global Soil Virus Atlas, a comprehensive dataset compiled from 2,953 previously sequenced soil metagenomes and composed of 616,935 uncultivated viral genomes and 38,508 unique viral operational taxonomic units. Rarefaction curves from the Global Soil Virus Atlas indicate that most soil viral diversity remains unexplored, further underscored by high spatial turnover and low rates of shared viral operational taxonomic units across samples. By examining genes associated with biogeochemical functions, we also demonstrate the viral potential to impact soil carbon and nutrient cycling. This study represents an extensive characterization of soil viral diversity and provides a foundation for developing testable hypotheses regarding the role of the virosphere in the soil microbiome and global biogeochemistry. This study presents an extensive global compendium of metagenomically derived sequences that will serve as a foundation for understanding the role of viruses in soil ecosystems.https://doi.org/10.1038/s41564-024-01686-x

1、至少 1 kb 的contigs，与 CheckV数据库中的基因组具有高度相似性（即具有高质量或中等完整性估计）或包含自动选择直接末端重复；（checkv_quality）
2、长于 10 kb 的contigs需要具有高于 0.8 的 geNomad 病毒评分（virus_score），并且编码一种病毒标志（例如，终止酶、衣壳蛋白、门户蛋白等）（n_hallmarks）（由 geNomad 确定），或者具有gNomad 病毒标记（marker_enrichment）至少为 5.0；
3、短于10kb和长于5kb的contigs需要具有高于0.9的geNomad病毒评分，编码至少一种病毒标志并且具有高于2.0的病毒标记富集。
这产生的病毒contigs，将其用于下游分析。

4、 优点和不足

4.1.优点

1. 自动化程度高：CheckV提供了完整的自动化流程，用户只需提供基因组序列文件即可进行全面的质量评估，大大节省了研究时间和人力成本。
2. 准确性高：通过结合多种算法和数据库，CheckV能够准确识别宿主污染、估计基因组完整性和识别封闭基因组，为病毒组学研究提供了可靠的工具。
3. 功能全面：CheckV不仅限于单一的质量评估任务，还提供了多种相关的分析功能，如预测病毒-宿主边界、下载最新数据库等，满足了用户多样化的需求。

4.2.缺点

1. 计算资源需求高：由于CheckV需要进行复杂的序列比对和数据分析，因此对计算资源的需求较高，可能不适合在资源有限的计算环境下运行。
2. 数据库更新频率：虽然CheckV提供了更新数据库的功能，但数据库的更新频率可能受到多种因素的影响，如新病毒序列的发现和验证速度等。因此，用户需要关注数据库的更新情况，以确保分析结果的准确性。
3. 学习曲线较陡：对于不熟悉命令行工具和生物信息学分析的用户来说，CheckV的学习曲线可能较陡。用户需要花费一定的时间和精力来熟悉其命令行界面、参数设置和分析流程。

 综上所述，CheckV 1.0.1是一个功能强大、自动化程度高的病毒基因组质量评估工具，在病毒组学研究中具有广泛的应用前景。

参考来源：berkeleylab / checkv — Bitbucket