病毒组学数据分析 -03 CheckV病毒序列识别

CheckV 是一个完全自动化的命令行管道，用于评估单重叠群病毒基因组的质量，包括识别集成原病毒的宿主污染、估计基因组片段的完整性以及识别封闭基因组。
管道可以分为4个主要步骤：
A：去除原噬菌体上的宿主污染

• 根据与自定义 HMM 数据库的比较，基因首先被注释为病毒或细菌
• CheckV 扫描重叠群（5' 到 3'），比较一对相邻ORF之间的基因注释和 GC 含量
• 此信息用于计算每个基因间位置的分数并识别宿主病毒断点
• 宿主-病毒断点标识为：
  • 高分 (>1.2)
  • 假定宿主区域中至少有 2 个宿主特异性基因（对于具有 >=10 个基因的重叠群）
  • 推定的病毒区域中至少有 2 个病毒特异性基因（对于具有 >=10 个基因的重叠群）
  • 在假定的宿主区域中至少有 30% 的基因被注释为细菌

B：估计基因组完整性（2 种算法）

• 基于 AAI 的方法（基因组完整性的精确点估计）
  • 首先，使用 AAI（平均氨基酸同一性）将蛋白质与 CheckV 基因组数据库进行比较
  • 在识别出最高命中后，完整性被计算为重叠群长度（或原噬菌体的病毒区域长度）与匹配的参考基因组长度之间的比率
  • 根据比对的强度和重叠群的长度报告置信水平
  • 一般来说，高可信度和中等可信度的估计是相当准确的，可以信赖
• 基于 HMM 的方法（基因组完整性的估计范围）
  • 高度新颖的病毒可能不匹配具有足够 AAI 的 CheckV 基因组（即低置信度估计）
  • 在这些情况下，CheckV 识别重叠群上的病毒 HMM，并将重叠群长度与共享相同 HMM 的参考基因组进行比较
  • CheckV 然后返回基因组完整性的估计范围（例如 35% 到 60% 的完整性），它代表基于具有相同病毒 HMM 的参考基因组长度分布的 90% 置信区间

C：预测封闭基因组（3个签名）

• 直接末端重复 (DTR)
  • 在 contig 的开始/结束处重复序列 >20-bp
  • 我们经验中最值得信赖的签名
  • 可能表示从环状模板（即串联体）复制的环状基因组或线性基因组
• 原噬菌体（原病毒）
  • 在 5' 和 3' 端预测宿主边界的病毒区域
  • 注意：如果宿主区域已被移除（例如使用 VIBRANT 或 VirSorter，Virsorter2中关闭原噬菌体预测），CheckV 将不会检测原噬菌体
• 反向末端重复 (ITR)
  • 在 contig 的起始/末端重复 >20-bp 的序列（3' 重复被倒置）
  • 根据我们的经验，最不可信的签名

CheckV 还将报告基于与完整性估计的比较的置信水平：

• 高置信度：>90% 的估计完整性
• 中等置信度：80-90% 的估计完整性
• 低置信度：<80% 估计完整性

对于 DTR 和 ITR，CheckV 执行一些额外的过滤/检查：

• 重复中的歧义碱基（例如“NNNNN”）：<= 20% 的重复序列带有 Ns
• 重复中的模式碱基频率（例如“AAAAA”）：<= 由单个碱基组成的重复序列的 75%
• 重复序列的最大出现次数：<= 每个重叠群 8 次（去除高度重复的序列）
• 最大kmer频率：<= 1.5（去除背靠背重复的相同基因组的重叠群）

D：总结质量。
根据 AC 的结果，CheckV 生成报告文件并将查询重叠群分配给五个质量层之一（与 MIUViG 质量层一致并扩展）：

• 完整（高度或中等置信度预测）
• 高质量（>90% 完整性）
• 中等质量（50-90% 的完整性）
• 低质量（<50% 完整性）
• 质量未定

安装

基于conda

conda install -c conda-forge -c bioconda checkv
#数据库下载（自动）
checkv download_database ./
#数据库下载（手动）
wget https://portal.nersc.gov/CheckV/checkv-db-v1.0.tar.gz
tar -zxvf checkv-db-v1.0.tar.gz
export CHECKVDB=/path/to/checkv-db-v1.0

使用

checkv end_to_end input_file.fna output_directory -t 16

结果解读

quality_summary.tsv

这包含来自三个主要模块的综合结果，主要输出。

contig_id	contig_length	provirus	proviral_length	gene_count	viral_genes	host_genes	checkv_quality	miuvig_quality	completeness	completeness_method	complete_genome_type	contamination	kmer_freq	warnings
1	5325	No	NA	11	0	2	Not-determined	Genome-fragment	NA	NA	NA	0	1	no viral genes detected
2	41803	No	NA	72	27	1	Low-quality	Genome-fragment	21.99	AAI-based (medium-confidence)	NA	0	1	flagged DTR
3	38254	Yes	36072	54	23	2	Medium-quality	Genome-fragment	80.3	HMM-based (lower-bound)	NA	5.7	1
4	67622	No	NA	143	25	0	High-quality	High-quality	100	AAI-based (high-confidence)	NA	0	1.76	high kmer_freq
5	98051	No	NA	158	27	1	Complete	High-quality	100	AAI-based (high-confidence)	DTR	0	1

在上面的例子中，有 6 个病毒重叠群的结果：

• 第一个 5325 bp 重叠群没有完整性预测，这由“checkv_quality”字段的“未确定”指示。这个重叠群也没有确定病毒基因，所以它甚至可能不是病毒。
• 第二个 41803 bp 重叠群被归类为“低质量”，因为其完整性 <50%。这是基于“AAI”方法的估计。请注意，quality_summary.tsv 文件中仅报告了高可信度或中等可信度的估计值。您可以查看“completeness.tsv”以获取更多详细信息。这个 contig 有一个 DTR，但它由于某种原因被标记（有关详细信息，请参阅 complete_genomes.tsv）
• 第三个重叠群被认为是“中等质量”，因为它的完整性估计为 80%，这是基于“HMM”方法。这意味着序列新颖性较高，基于 AAI 估计完整性不准确，但与 CheckV 参考基因组共享一个 HMM。请注意，此值代表一个下限（意味着真正的完整性可能高于但不低于此值）。请注意，该重叠群也被归类为原噬菌体。
• 第四个重叠群被归类为高质量，基于 >90% 的完整性。但是，请注意“kmer_freq”的值为 1.7。这表明病毒基因组在重叠群中多次出现。这些情况非常罕见，但需要注意。
• 根据直接末端重复序列 (DTR) 的存在，第五个重叠群被归类为完整的，并且根据 AAI 方法具有 100% 的完整性。该序列可以放心地视为一个完整的基因组。

completeness.tsv

关于如何估计完整性的详细概述

contig_id	contig_length	proviral_length	aai_expected_length	aai_completeness	aai_confidence	aai_error	aai_num_hits	aai_top_hit	aai_id	aai_af	hmm_completeness_lower	hmm_completeness_upper	hmm_hits
1	9837	5713	53242.8	10.7	high	3.7	10	DTR_517157	78.5	34.6	5	15	4
2	39498	NA	37309	100	medium	7.7	11	DTR_357456	45.18	30.46	75	100	22
3	29224	NA	44960.1	65.8	low	15.2	17	DTR_091230	39.74	19.54	52	70	10
4	23404	NA	NA	NA	NA	NA	0	NA	NA	NA	NA	NA	0

在上面的例子中，有 4 个病毒重叠群的结果：

• 使用基于 AAI 的方法 (100 x 5713 / 53242.8)，第一个前病毒重叠群的估计完整性为 10.7%。此估计的置信度很高，基于 3.7% 的相对估计误差，这又基于 aai_id（平均氨基酸同一性）和 aai_af（重叠群的比对分数）与 CheckV 参考 DTR_517517
• 第二个重叠群使用基于 AAI 的方法具有 100% 的完整性，使用基于 HMM 的方法具有 75-100% 的完整性范围。请注意，重叠群长度比预期的基因组长度 37,309 bp 稍长。
• 根据 AAI 方法，估计第三个重叠群完成了 65.8%。然而，我们不能完全相信这一点，因为 aai_confidence 很低（意味着基于 AAI 的最高命中相当弱）。为保守起见，我们可能希望报告基于 HMM 方法的完整性范围 (52-70%)
• 最后一个 contig 没有任何基于 AAI 的命中，也没有任何病毒 HMM，所以我们对这个序列无话可说

contamination.tsv

如何估计污染的详细概述：

contig_id	contig_length	total_genes	viral_genes	host_genes	provirus	proviral_length	host_length	region_types	region_lengths	region_coords_bp	region_coords_genes	region_viral_genes	region_host_genes
1	98051	158	27	1	No	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
2	38254	54	23	2	Yes	36072	2182	host,viral	1-2182,2183-38254	1-2182,2183-38254	1-4,5-54	0,23	2,0
3	6930	9	1	2	Yes	3023	3907	viral,host	30,233,907	1-3023,3024-6930	1-5,6-9	1,0	0,2
4	101630	103	7	24	Yes	28170	73460	host,viral,host	468,042,817,026,656	1-46804,46805-74974,74975-101630	1-43,44-85,86-103	0,7,0	13,0,11

在上面的例子中，有 4 个病毒重叠群的结果：

• 第一个 contig 不是预测的原病毒（原噬菌体）
• 第二个 contig 有一个预测的宿主区域，覆盖 2182 bp
• 第三个 contig 在左侧有一个宿主区域,，覆盖6930 bp
• 第四个 contig 有 101630 bp其中有103 个基因，包括 7 个病毒基因和 24 个宿主基因。CheckV 确定了两个宿主病毒边界

complete_genomes.tsv

已确定的假定完整基因组的详细概述：

contig_id	contig_length	prediction_type	confidence_level	confidence_reason	repeat_length	repeat_count
1	44824	DTR	high	AAI-based completeness > 90%	253	2
2	38147	DTR	low	Low complexity TR; Repetetive TR	20	10
3	67622	DTR	low	Multiple genome copies detected	26857	2
4	5477	ITR	medium	AAI-based completeness > 80%	91	2
5	101630	Provirus	not-determined	NA	NA	NA

在上面的例子中，有 5 个病毒重叠群的结果：

• 第一个病毒重叠群具有 253 bp 的直接末端重复序列。根据估计的完整性 > 90%，它被归类为高置信度
• 第二个病毒重叠群具有 20 bp 的 DTR，但 DTR 复杂度低且不可信，导致置信度低。DTR 也发生 10 倍，并且被认为是重复的。
• 第三个病毒重叠群的 DTR 为 26857 bp！这表明基因组的很大一部分是重复的。CheckV 将这些归类为低置信度，但用户可能需要手动解决这些重复
• 第四个病毒重叠群的 ITR 为 91 bp。基于 AAI 的完整性 > 80%，这被认为是中等置信度
• 第五个病毒重叠群的两侧是宿主（前病毒）。但是 CheckV 无法评估完整性，因此置信度未确定

end_to_end 帮助文档和总文档

input         以FASTA格式输入核苷酸序列（支持.gz，.bz2和.xz文件）
  output        输出目录

optional arguments:
  -h, --help    显示此帮助消息并退出
  -d PATH       引用数据库路径。默认情况下，使用 CHECKVDB 环境变量【添加后可不写】
  --remove_tmp  从输出目录中删除中间文件
  -t INT        用于Prodigal和DIAMOND的线程数
  --restart     覆盖现有的中间文件。默认情况下，CheckV 在程序中断的地方继续
  --quiet       禁止记录消息
  
  
programs:
    end_to_end          运行完整的管道以估计完整性，污染并识别封闭的基因组
    contamination       识别并消除集成前病毒上的宿主污染
    completeness        估计基因组片段的完整性
    complete_genomes    根据末端重复序列和侧翼宿主区域识别完整基因组
    quality_summary     跨模块汇总结果
    download_database   下载最新版本的CheckV数据库
    update_database     使用您自己的完整基因组更新CheckV的数据库

参考文献

Bitbuckethttps://bitbucket.org/berkeleylab/checkv/src/master/