宏基因组中的病毒组分析（4）CoverM计算RPKM

宏基因组中的病毒组分析：

第一步：宏基因组中的病毒组分析（1）病毒序列的鉴定geNomad-CSDN博客

第二步：宏基因组中的病毒组分析（2）checkV评估病毒基因组的质量-CSDN博客

第三步：宏基因组中的病毒组分析（3）CD-HIT聚类vOTU-CSDN博客

第四步：使用 CoverM v0.6.1 计算 vOTU 的 RPKM 值

CoverM v0.6.1 是一款专注于宏基因组学应用的覆盖度计算工具。它基于映射（mapping）技术，通过读取和分析比对（mapping）结果来评估一组contigs或genomes的覆盖情况。

1、工作原理

CoverM能够接收BAM格式的序列比对文件（如由bwa-mem等比对工具生成的），以及FASTA格式的参考基因组文件，然后计算每个参考序列区域的覆盖深度，从而帮助研究人员了解宏基因组测序数据的覆盖均匀性和完整性。

2、安装  

可以直接通过conda安装，安装命令如下：

#创建环境
conda env create -n coverm 
#安装coverM
conda install coverm

 或者从GitHub中下载对应操作系统的预编译二进制文件，也可以从源码编译安装，但需要预先安装Rust环境。

3、运行

coverM可以处理genome和contig两种类型。

3.1. genome-计算基因组的覆盖率

计算genomes的覆盖度，可以使用命令：

coverm genome <GENOME_DESCRIPTION> <MAPPING_INPUT> ..
#例如
 coverm genome --bam-files my_sorted_bam.bam --genome-fasta-directory genomes/

首先对于mapping的参数，有几种类型：

-1 ： Forward FASTA/Q file(s) for mapping. 
-2 ： Reverse FASTA/Q file(s) for mapping
#这两个可以是压缩文件也可以不是

-c/--coupled ：一对或者多对forward和reverse的被压缩的FASTA/Q file(s)
#例如：<sample1_R1.fq.gz> <sample1_R2.fq.gz> <sample2_R1.fq.gz> <sample2_R2.fq.gz> ..

--interleaved ：属于interleaved的mapping文件，FASTA/Q file(s)
--single ：未配对的 FASTA/Q 文件进行mapping
#这两个可以是压缩文件也可以不是

-b/--bam-files ：BAM 文件的路径。除非指定，否则这些必须进行引用排序（例如使用 samtools sort），在这种情况下，它们必须进行读取名称排序。

对于基因组的定义：

-f， --genome-fasta-files
每个基因组的 FASTA 文件的路径，例如 .pathA/genome1.fna pathB/genome2.fa

d， --genome-fasta-directory 
包含每个基因组的 FASTA 文件的目录

-x， --genome-fasta-extension
使用 . 指定的目录中基因组的文件扩展名。[默认：-d/--genome-fasta-directoryfna]

--genome-fasta-list 
包含 FASTA 文件路径的文件，每行一个。

-r， --reference 路径
重叠群的 FASTA 文件，例如串联基因组或宏基因组组装，或 minimap2 索引（带）、频闪索引（带）或 BWA 索引茎（带）。如果提供并指定了多个引用 FASTA 文件，则读取将作为分片 BAM 单独映射到引用。注意：如果在其他地方指定了基因组 FASTA 文件（例如，使用 或 ），则不需要作为参考 FASTA 文件，可以通过连接输入基因组来派生。在这些情况下，如果需要备用参考序列集，则可以选择指定。--minimap2-reference-is-index--strobealign-use-index-p bwa-mem/bwa-mem2--sharded--genome-fasta-files--genome-fasta-directory--reference--reference

-s， --separator 字符
此字符将参考文件中的基因组名称与重叠群名称分开。需要。[默认值：未指定]--reference

--单基因组
所有重叠群都来自同一个基因组。需要。[默认：未设置]--reference

--genome-definition 文件
包含 genome_name<tab> 重叠群行列表的文件，用于定义每个重叠群的基因组。需要。[默认：未设置]--reference

--use-full-contig-names
指定输入 BAM 文件是使用映射软件生成的，该软件在参考定义中包含每个重叠群的全名（即空格后的字符），以便在读取基因组时，按原样记录重叠群名称。

3.2. contig - 计算每个重叠群组的读取覆盖率

计算contig的读取覆盖率，可以使用命令：

coverm contig <MAPPING_INPUT> ..

contig的计算比genome要相对简单，只需要输入一个mapping的参数，与genome相同，此处不再赘述了。

contig需要输入一个参考路径，即contig的FASTA文件

-r， --reference 
重叠群的 FASTA 文件，例如串联基因组或宏基因组组装。[除非另有说明，否则为必填项]

3.3阈值的选择

阈值的选择可以根据需求从文献中获取，我采用的是以下阈值：

-min-read-percent-identity 0.95、-min-read-aligned-percent 0.75、-contig-end-exclusion 0 和 -m rpkm

3.4.注意事项

我在进行计算时，mapping的参数选择经常报错，后面采取了-1和-2的方式，将forward和reverse的fastq文件单独输入，基本没有报错，可以多尝试一些方法。

4、优缺点

4.1.优点

1. 专注于宏基因组学：CoverM特别针对宏基因组学数据的覆盖度计算进行了优化，能够处理大规模的数据集。
2. 灵活性强：支持多种输入格式和参数配置，用户可以根据具体需求灵活调整。
3. 易于使用：通过简单的命令行接口即可使用，无需复杂的图形用户界面。
4. 性能高效：基于Rust语言编写，具有较高的执行效率和稳定性。

4.2.缺点

1. 依赖外部工具：虽然CoverM本身功能强大，但通常需要与bwa-mem、samtools等外部工具结合使用，增加了使用的复杂性。
2. 学习曲线：对于不熟悉命令行工具的用户来说，可能需要一定的时间来熟悉和学习CoverM的使用方法。
3. 配置管理：CoverM的配置主要通过命令行参数实现，对于复杂的重复任务，可能需要手动编写脚本来管理配置，不如使用配置文件那样直观和方便。
4. 安全性问题：虽然CoverM v0.6.1 版本的具体安全性问题未明确提及，但软件更新迭代中可能存在安全漏洞，需要用户及时关注并更新到最新版本。

5.总结

 综上所述，CoverM v0.6.1 是一款功能强大、灵活易用的宏基因组学覆盖度计算工具，适用于科研人员在进行宏基因组学数据分析时评估数据的覆盖情况。然而，用户在使用时需要注意与其他工具的兼容性、学习命令行接口以及关注软件的安全性更新。

参考来源：wwood/CoverM: Read coverage calculator for metagenomics (github.com)