SPR的操作记录

表面等离子共振技术-去年做的实验好多都忘记了---测定蛋白质与小分子的动力学亲和力

翻出笔记开始记录一下，回忆起来就补充，下次做实验还有的看

也就操作了一周，东学一点西学一点

其实有说明书，但是做起来还是不太一样的，由很多细节

准备：SPR仪器（平台的，Biacore S200），CM5芯片（购买的），氨基偶联试剂盒（没有买，使用的平台），DMSO细胞级会比较好，PBS缓冲溶液，纯水，1mM Nacl，三种不同pH值的醋酸钠缓冲溶液（5.5，5.0，4.5，用来寻找最佳偶联的条件，摸索，平台准备）。

缓冲溶液PBST（配置的）：PBS+吐温0.5%+DMSO 5%，准备40mL

蛋白质（>200 ug/mL，我配置的是600ug/mL浓度稍微高一点），不含tris，不含盐，蛋白质分子量我的是48KD，后面用来计算连接的偶联量RL，RUX(小分子测试中通常代入100RU)=小分子的分子量/蛋白质分子量*RL(配体偶联水平)*SM(化学计量比，通常未知是1)，比如我的小分子分子量基本上在400左右，100=400/48000*RL*1，RL=12000RU,后面富集的偶联量要基本上接近这个数值。

小分子：先配置母液（DMSO，>10mM）不能含有咪唑，蔗糖，甘油，纯度>90%,我做实验的时候配置的是20 mM的母液，总共是60个，一定做好标记

等浓度初筛使用浓度为100 uM,从20 mM-2 mM（100uL,10+90 DMSO）-100uM (200 uL,最后的缓冲液是PBST，10+190)  注释：吐温 0.5%，DMSO 5%

准备好一切，先要连接蛋白，有的蛋白是不好挂在芯片上的，那样不能后续实验了

1.蛋白预富集实验，找合适的醋酸钠缓冲溶液。蛋白质/醋酸钠缓冲溶液=1/1.5。我们尝试了两个缓冲溶液的pH,75uL蛋白质+112.5 uL pH=5.0醋酸钠缓冲溶液，pH=5.0,4200RU / 50 uL蛋白质+75 uL pH=5.0醋酸钠缓冲溶液pH=4.5，4130RU，选择pH=5.0。

最终用的100 uL蛋白质+100 uL pH=5.0醋酸钠缓冲溶液，富集的Rl=9900，近一万可以使用。

封闭剩余的通道，总共有四个通道，用NHS和乙醇胺

2.小分子的配制

3.所需要的各种试剂的配制

其中标准曲线的建立非常重要，准备好八个管的浓度的标准溶液

4.单浓度检测

布板的时候一定看好所需要的最少体积，及时补充体积，尤其是标曲还有再生和洗涤溶剂

5.选取单浓度检测响应值高的小分子进行小分子的梯度浓度配制

4.测定,设置结合和解离的时间，我们用的是120s/180s。解离用的溶液就是1mM的氯化钠

结束后

数据处理直接用自带的分析软件进行数据处理，导出图片使用，也可以导出原始数据回来自己用Graphpad prism或者excel处理数据作图。还得到处翻一下笔记，找的很乱，不好的笔记习惯，的纠正。

补充