Science Advances: 类配对分析法揭示孤独症患者肠道菌群解毒功能受损
标题：类配对法揭示孤独症谱系障碍儿童肠道微生物解毒功能受损
Title:A quasi-paired cohort strategy reveals the impaired detoxifying function of microbes in the gut of autistic children
DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.aba3760
第一作者：Mengxiang Zhang（张梦想）, Yanan Chu（楚亚男）, Qingren Meng（孟庆仁）
通讯作者：Juan Wang（王娟）, Yu Kang（康禹）
主要单位：北京大学医学部基础医学院医学生物信息学系（Department of Biomedical Informatics, School of Basic Medical Sciences, Peking University）
北京大学孤独症研究中心（Autism Research Center of Peking University Health Science Center）
中科院北京基因组研究所（CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, and China National Center for Bioinformation）
摘要
越来越多的证据表明，孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）与肠道微生物组的功能失调密切相关，但其确切机制仍不清楚。研究者提出了一种新的分析策略，类配对分析法，并将其应用于ASD患者微生物的宏基因组研究。通过比较配对的ASD组和对照组儿童的肠道微生物功能，研究者发现ASD儿童的解毒酶和解毒途径明显受损，这与线粒体功能障碍的生物标志物显著相关。应用随机森林的方法，构建了基于解毒酶的疾病诊断模型，可将ASD个体与对照组准确区分（AUC 88%），且模型计算出的功能障碍得分与ASD的临床评分呈正相关。研究结果表明，肠道微生物解毒功能受损在毒素积累和线粒体功能障碍中具有以前未发现的潜在作用。这些发现为增强ASD患者肠道微生物的解毒能力、寻找有效的ASD干预措施和治疗方法提供了新的方向。
背景
孤独症是一类复杂的神经发育障碍性疾病，以受损的社交功能、重复刻板行为、狭窄兴趣为主要特征。在世界范围内，孤独症的发病率逐渐攀升，2020年美国疾病预防中心发布数据显示美国8岁儿童的孤独症患病率为1/54。很多研究显示肠道菌群在孤独症中起到重要作用。许多ASD儿童存在胃肠道共患病，且由于感觉异常和食物过敏，普遍存在挑食现象，可能影响共生菌的定植，导致菌群失调。
基于鸟枪法测序的宏基因组研究被广泛应用于寻找微生物参与的疾病发病因素。与16S rDNA测序相比，宏基因组测序提供了更全面的关于微生物功能的信息，以及有更高的物种分辨率。但是，受遗传、年龄、饮食和健康等多种因素影响，个体肠道菌群组成具有高度异质性，且受复杂的代谢网络影响，因此需要比较具有相似代谢背景个体的代谢通路的差异，以排除环境、遗传等因素造成的干扰（类似于基因组分析中的双胞胎研究）。
基于这些因素，研究者开发了一种新型的宏基因组分析策略，即类配对分析法，对39份ASD组样本和40份对照组样本进行配对，将原始的分组转换为边界配对组，以降低个体异质性同时增加统计功效。结果发现，在孤独症组中，肠道菌群的毒素降解通路显著降低，且与机体线粒体功能损伤相关。
主要方法
图1：
（A）ASD儿童和健康对照儿童的小组队列；
（B）构造一个高维空间，每个微生物组特征代表一个维，然后放置样本。删除与其他样本距离过远（用蓝色矩形标记）或太近（用粉红色矩形标记）的样本；
（C）在两组样本中，选择靠近决策边界（黑线）的边界样本，并将它们分别与来自相反组的距离最近的样本配对；
（D）构建类配对队列，并用于检验ASD和对照样本之间每个维度（微生物特征）差异的显著性。
主要结果
1.孤独症儿童的解毒酶和解毒通路存在明显受损
热图显示了配对队列中每个样本中各解毒酶的相对丰度，颜色表示以z得分归一化的相对丰度。热图左侧为与ASD相关的代表性通路，右侧为代表性基因。其中，共5条毒素降解相关的通路在ASD中下降，两条通路与谷胱甘肽合成有关，分别为γ-谷氨酰循环通路和谷氨酸盐及谷氨酰胺合成通路，谷氨酰胺和谷氨酸盐是谷胱甘肽的前体物质，另外三条毒素降解通路为甲基膦酸酯（Methylphosphonate）、3-苯基丙酸酯（3-phenylpropanoate）和3-(3-羟苯基)丙酸甲酯（3-(3-hydroxyphenyl)-propanoate、丙酮醛降解通路，这些通路上所有的酶都在ASD组中下降。
如图2：
2.ASD儿童肠道解毒通路受损与线粒体功能障碍的生物标志物显著相关
图3：
（顶部）ASD和对照组中，线粒体功能障碍样本的每种尿液生物标志物（名称位于热图下方）的平均浓度。y轴为它们的浓度（通过相同样本的肌酸浓度归一化的μmol）。当与对照组相比时，大部分ASD儿童存在代谢异常；ASD组尿液有机酸浓度有异常的为线粒体标记物乌头酸、辛二酸、2-羟基马尿酸、延胡索酸等代谢物水平升高，这表明ASD儿童的三羧酸循环发生障碍。
（底部）不同解毒酶与尿液生物标志物之间相关性热图，两者呈负相关关系。
3. 鉴定出的解毒酶用于构建孤独症诊断模型
应用随机森林的方法，研究者构建了基于解毒酶的疾病诊断模型
图4：
（A）ROC分析诊断模型的性能，AUC值为88%，具有较高的诊断性能；
（B）每种解毒酶基于1000步置换检验的平均贡献；
（C）ASD临床得分与诊断模型的得分呈正相关，说明肠道微生物解毒功能降低会影响ASD的严重程度。
总结
本研究对孤独症儿童和对照儿童肠道微生物采用类配对分析的方法，排除了饮食、遗传等因素导致的肠道菌群差异，发现肠道菌群解毒功能在孤独症儿童中受损，且与患者线粒体功能障碍及症状严重程度相关，基于发现的解毒酶构建疾病诊断模型，能够准确区分孤独症患者与对照组，且模型计算出的功能障碍得分与孤独症的临床评分呈正相关。这一发现为孤独症研究和干预策略制定提供新的方向。
参考文献：Zhang M, Chu Y, Meng Q, Ding R, Shi X, Wang Z, He Y, Zhang J, Liu J, Zhang J, Yu J, Kang Y, Wang J. A quasi-paired cohort strategy reveals the impaired detoxifying function of microbes in the gut of autistic children. Sci Adv. 2020 Oct 21;6(43):eaba3760. doi: 10.1126/sciadv.aba3760. PMID: 33087359.
通讯作者
责任作者王娟简介
王娟，北京大学医学部基础医学院医学生物信息学系副教授，北京大学医学部孤独症研究中心秘书长，主要研究方向是疾病的系统生物学研究，致力于应用多组学技术挖掘孤独症病因学机制。已在Science Advances、Nucleic Acids Research、 Trends in Molecular Medicine、 Briefings in Bioinformatics、 Scientific Reports等杂志发表论文十余篇。
责任作者康禹简介
康禹，中国科学院北京基因组研究所副研究员，主要研究方向为微生物基因组和测序技术，致力于应用新型测序技术和分析方法，探索微生态在维持人体健康中的作用，寻找疾病相关的组学标志。迄今以通讯作者在Science Advances、Nuclear Acid Research、mSystems、mBio等杂志发表论文十余篇。
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