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幼龄反刍动物粪便DNA提取及注意事项
DNA Extraction from the Faeces of Young Ruminants
王佳堃*，杨斌，陈宏伟
奶业科学研究所，动物科学学院，浙江大学，杭州，浙江
*通讯作者邮箱: jiakunwang@zju.edu.cn
摘要：幼龄反刍动物的粪便粘度大，蛋白质含量高，采用普通粪便或消化道内容物DNA的提取方法难以获得高质量、高纯度的DNA。本实验方法基于机械破碎裂解细胞，再通过酚氯仿溶液反复抽提样本中的核酸，采用RNase A溶液消化样本中的RNA，进一步利用商品化的吸附柱纯化核酸样品，从而得到高纯度的DNA。该方法提取的幼龄反刍动物粪便DNA能够满足微生物多样性分析等测定要求。
关键词：幼龄反刍动物，粪便，DNA，提取
背景
幼龄反刍动物的胎粪水分含量低，粘稠度高，不利于DNA的提取。动物出生后数天内，体内的胎粪尚未完全排出，胎粪与消化后的奶进一步混合，使得粪便的成分更加复杂，从而加大了后续DNA提取的难度。采用普通粪便或消化道内容物DNA的提取方法难以获得高质量、高纯度的粪便DNA样品，无法满足后续微生物多样性等分析的要求。为此，本文提供一种幼龄反刍动物粪便DNA的提取方法，旨在为幼龄反刍动物粪便微生物等后续分析提供便利。
材料与试剂
1.无菌枪头
2.2 ml研磨管 (研磨仪配套或其他适配研磨仪离心管均可)
3.1.5 ml、2 ml离心管 (浙江同力信息科技有限公司, catalog number: 68800012)
4.0.1 mm、0.5 mm和2 mm氧化锆球磨珠
5.Tris饱和酚溶液 (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A504193)
6.氯仿-异戊醇，24:1 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 25668)
7.酚氯仿，25:24:1 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 77617)
8.RNase A，10 mg/ml (生工生物工程股份有限公司, catalog number: B500474)
9.乙醇95% (国药集团化学试剂有限公司, catalog number: 10009128)
10.乙醇70%
11.核酸纯化吸附柱 (生工生物工程股份有限公司, catalog number: B615005)
12.灭菌超纯水
13.Tris (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A100826)
14.乙二胺四乙酸二钠盐二水 (EDTA, 生工生物工程股份有限公司, catalog number: A500838)
15.NaAc·3H2O (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A610481)
16.冰醋酸 (生工生物工程股份有限公司, catalog number: A501931)
17.3 M醋酸钠，pH 5.2 (见溶液配方)
18.TE缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
1.研磨仪 (上海净信实业发展有限公司, catalog number: JXFSTPRP-24)
2.离心机 (赛默飞世尔科技有限公司, catalog number: SL40)
3.超净台 (上海博迅医疗生物仪器股份有限公司, catalog number: VS-840-1)
4.涡旋仪 (大龙兴创实验仪器股份公司, catalog number: MX-S)
5.-20 °C冰箱
实验步骤
1.称取约0.2 g粪便样品至2 ml研磨管，加入1 ml TE缓冲液，0.1 mm和0.5 mm氧化锆球磨珠各0.15 g，2 mm氧化锆球磨珠2颗。
2.向研磨管中继续加入200 μl饱和酚溶液，使用研磨仪物理破碎，65 Hz运行30 s，停顿10 s，重复三次。
3.加入200 μl氯仿-异戊醇，在涡旋仪上充分震荡混匀，4 °C、18,500 × g离心15~30 min。
4.吸取上清液至新的2 ml离心管，加入450 μl酚氯仿，在涡旋仪上充分震荡混匀，4 °C、18,500 × g离心15~30 min。
5.重复步骤4至中间蛋白层澄清。
6.吸取上清液至新的2 ml离心管，加入450 μl氯仿-异戊醇，在涡旋仪上充分震荡混匀，4 °C、18,500 × g离心15~30 min。
7.吸取上清液至新的2 ml离心管，加入RNase A溶液至终浓度为0.04 mg/ml，37 °C水浴15 min。
8.加入1/10倍体积3 M醋酸钠 (pH 5.2) 和2倍体积95%乙醇 (-20 °C预冷)，上下颠倒混匀，-20 °C 30 min以上。
9.次日，将混合液转移到吸附柱中，4 °C、15,700 × g离心3 min，弃掉滤液。重复该过程直至混合液全部转移完毕。
10.加入500 μl 70%乙醇 (-20 °C预冷)，4 °C、15,700 × g离心3 min，弃掉滤液。重复该操作一次。
11.弃掉滤液，在4 °C、15,700 × g离心5 min，将吸附柱转移到新的1.5 ml离心管中，在超净台内干燥90 s。
12.加70 μl灭菌超纯水或TE缓冲液，室温下静置2 min。4 °C、15,700 × g离心2 min。
13.将滤液重新加入吸附柱，4 °C、15,700 × g离心2 min，获得DNA样品。
结果
采用本方法提取了1-78日龄的犊牛粪便DNA，获得的DNA浓度为100-1300 ng/μl，A260/280为1.62-1.95，A260/230为1.51-2.06，DNA样本能够满足微生物多样性分析的要求。
图1. 采用本方法提取的犊牛粪便DNA琼脂糖电泳图
溶液配方
1.TE缓冲液
1)1 M Tris-HCl溶液
准确称取121.14 g Tris，溶于800 ml超纯水中，用HCl调节pH至7.6，用超纯水定容至1 L
2)0.5 M EDTA溶液
准确称取18.61 g EDTA，溶于80 ml超纯水中，用NaOH调节pH至8.0，用超纯水定容至100 ml
注：溶液pH小于8.0时，EDTA难以完全溶解。
3)将配制好的1 M Tris-HCl溶液和0.5 M EDTA溶液混合，Tris-HCl和EDTA的终浓度分别为10 mM和1 mM。121 °C灭菌15 min。
2.3 M醋酸钠，pH 5.2
准确称取408.1 g NaAc·3H2O溶解于800 ml超纯水中，用冰醋酸调节pH至5.2，用超纯水定容至1 L。121 °C灭菌15 min。
致谢
本实验方法改编自Zoetendal等 (2006) 人类消化道微生物DNA的提取方法，感谢Zoetendal等的研究工作。
参考文献
1.Zoetendal, E. G., Heilig, H. G., Klaassens, E. S., Booijink, C. C., Kleerebezem, M., Smidt, H. and de Vos, W. M. (2006). Isolation of dna from bacterial samples of the human gastrointestinal tract. Nature Protocol 1(2): 870-3.
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