题目：Shared features and reciprocal complementation of the Chlamydomonas and Arabidopsis microbiota
发表杂志：Nature Communications
发表年月：2022年1月
通讯作者：Ruben Garrido-Oter
单位：Department of Plant-Microbe Interactions, Max Planck Institute for Plant Breeding Research, 50829, Cologne, Germany
Cluster of Excellence on Plant Sciences, 40225, Düsseldorf, Germany
影响因子：14.9
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-28055-8
植物地上和地下部分都能从周围环境中招募微生物群落，它们可以帮助植物抵御非生物逆境、获取营养、抵御病原菌等。陆生植物根际（rhizosphere）可以分泌一些物质改变土壤pH、氧可及性、抗生物质的含量等特异性募集/抑制一些微生物。类似的，水生环境下，藻类可以形成藻际（phycosphere），在这里它可以和其募集的微生物交换代谢物如有机碳、可溶性微量营养元素、维生素等，进而影响藻类的生长发育。然而陆生植物和藻类的募集模式相似或差别还是不清楚的。
2022年1月20日，德国马普所Ruben Garrido-Oter组在Nature Communications杂志上发表了题为Shared features and reciprocal complementation of the Chlamydomonas and Arabidopsis microbiota的论文，对上述问题进行了研究。
摘要
微藻释放有机化合物到其细胞周围被称为藻际（phycosphere）的区域，构成了异养细菌定殖的生态位。这些细菌吸收藻类的光合产物并为其宿主提供益处，类似于陆生植物根和根际微生物群落与其宿主的关系。本研究中，我们表征了模式藻类Chlamydomonas reinhardtii（Cr）的微生物群落并揭示了它和陆生植物根微生物群落广泛的物种和功能重叠。利用来自Cr和拟南芥的合成群落，我们发现藻际和根细菌在它们的宿主上组装出物种组成相似的群落。我们还发现提供可扩散的代谢物对藻际群落的建立来说是不够的，还需要和宿主的物理接近作用。我们的数据表明，尽管Cr和拟南芥存在巨大的进化距离，但仍存在驱动拟南芥根和Cr藻际微生物群组装的共同生态原则。
结果
Cr拥有和周围土壤不同的微生物群落
作者首先做了下面这个实验：表面消毒的拟南芥和无菌Cr种植到相同的自然土（Cologne Agricultural Soil，CAS）中，然后间隔7天取样，测16S细菌扩增子。
发现藻际和根α多样性比根际和土壤要低（图1A）。β多样性发现藻际和根与土壤以及根际有不同的群落（图1B）。第二和第三主成分发现藻际和根分不开，表明它们有相似的细菌群落（图1C）。然后作者用超几何分布模拟Cr和拟南芥从同一土壤募集微生物群，也发现它们的重叠是显著的（P = 3.06 × 10−33），且不能被随机募集过程解释。
图1 A α多样性分析。B和C Bray–Curtis距离的PCoA分析（constrained by compartment）。D 拟南芥根（120）和藻际（141）最丰富（相对丰度>0.1%）的ASVs的系统发育分析。
然后作者为了研究微生物群落组装动态，他们分析了这些时间序列的样本，发现第7天就已经与初始接种群落有很大差异。藻际和根富集的ASVs在各自的部位富集，藻际有一个逐渐增加的趋势，而土壤富集的ASVs则在这些采样时间点没有很大变化。
作者还探究了一下藻际微生物群落的组装在自然发生并增殖的微藻存在与否。把CAS土浇水并在光照和黑暗12/12h的循环中7周，一直黑暗的作为对照（下图所示），最后测16S和18S扩增子，测叶绿素含量。发现在有光照条件下，叶绿素含量显著增加，18S扩增子测到的绿藻门含量也更高。其中Chlamydomonas 是含量最高的真核生物之一。光照处理组细菌群落也和黑暗对照区分开，且和前面Cr的群落聚类靠近。
Cr藻际和拟南芥根共享核心微生物群
作者比较了Cr藻际和拟南芥根高丰度的菌（图1D），发现他们共享除了Myxococcales（Cr藻际没有）之外的所有高丰度目。相比于拟南芥根，Cr藻际有更低丰度的Actinobacteria 和更高丰度的 Firmicutes。因为Firmicutes在土壤中是最丰富的菌，因此，可能是收集藻际样品时不能把土壤很好分离开造成的。
接着作者为了研究这种共享是否可以拓展到其它陆生植物，整合分析了进化多样的植物，包括石松、蕨类、裸子植物、被子植物、豆科模式植物百脉根。发现Caulobacterales, Rhizobiales, Sphingomonadales, Burkholderiales, Xanthomonadales (Proteobacteria), 和 Chitinophagales (Bacteroidetes)存在于每种植物中，平均总相对丰度39%（图2）。有意思的是，这些物种也存在于Cr藻际（平均总相对丰度45%）和CAS土中自然生长的藻类（平均总相对丰度33%）。这些结果表明，陆生植物的核心微生物也与绿藻相关，且形成陆生环境中藻际群落的一部分。
图2 光合生物根和藻际保守的细菌目
利用还原论方法重建藻际微生物群落
接下来作者做了下面这个实验：把Cr或人工光合作用产物（artificial photosynthates，AP）添加到两个不同自然土壤的浸提液，在无碳源的培养基（TP和B&D）中共培养，建立复杂性更低的可操控的一个微宇宙系统。注意这个系统是持续光照11天的。这样可以保证微生物生长所需的碳源来自Cr或AP。
首先发现土壤浸提液对Cr没有产生有害影响（附图）。Cr在第四天已经可以塑造微生物组了，且在实验结束时依然保持稳定（图3A）。没有有机碳或AP时导致了显著不同的微生物群落（图3A）。如果Cr被热灭活则没有这种现象（附图）。用5μm滤膜过滤掉大的真核生物得到的规律相似（附图）。Cr富集的ASVs逐渐增加，而只有细菌对照组所富集的ASVs则逐渐减少（图3B）。这可能是由于在这个液体培养系统中不能利用Cr光合产物细菌减少导致的。在另一个光照黑暗交替的实验中，得到了虽然推迟但是一致的模式。
图3 A 基于Bray-Curtis距离的PCoA分析（constrained by condition），ASVs水平分析的。B 各个条件富集ASVs的动态变化。
为了探究Cr之外的绿藻藻际是否有相同的装配模式，作者选了其它从相同陆地环境分离的藻类，包含Trebouxiophyceae (Microthamnion)，Chlorophyceae (Chlamydomonas)， Klebsormidium (Klebsormidiophyceae），Zygnematophyceae （Spiroglea）进行了同上的微宇宙实验（见下图）。发现这些藻类可以装配和它们进化关系对应的微生物群落（附图）。实验室的Cr和一个环境中的Chlamydomonas sp. (MEL 1030 B)距离最近（附图），表明实验室和环境条件的相近藻类都与土壤微生物有相似的互作模式。此外，与根核心微生物组共享的微生物是藻际的优势菌。
随后作者利用极限稀释法从添加了CAS土壤浸提液、不含碳源的基础培养基（TP和B&D）生长7天的Cr中分离得到1645个菌（称为Cr-IPL），用16S扩增子鉴定。总共恢复了62%的之前不依赖培养扩增子测序结果中的高丰度菌（附图），恢复的ASVs的累积相对丰度占到了不依赖培养的63%。这和之前拟南芥（57%）、水稻（69%）和百脉根（53%）中恢复的比例相当。
选取系统发育代表性的185个菌（5门15科，称为Cr-SPHERE）进行全基因组测序，之后把它和同样来自CAS土壤、拟南芥根和百脉根根和根瘤的可培养菌进行了比较基因组分析。根来源的主要菌株也出现在Cr-SPHERE，但不出现在土壤中（附图）。Cr-SPHERE也包含许多在自然土中生长的植物根中都定殖的6个细菌目中（图2）。基于KEGG功能分析发现，细菌物种分类是数据的主要变异来源，而宿主起源则只有很小的影响（附图）。
接下来作者选取了26个16S可以区分开，且代表Cr-IPL的菌替换上面提到的自然土进行类似的装配实验，见下图。
然后发现这26个菌组成的SynComs同样对Cr繁殖没有持续的好或坏的作用（图4A，B）。在前4天内形成了不同于起始接种液的群落（图4C，D）。
图4 A Cr细胞量。B Cr荧光量。C Bray-Curtis距离的CPCoA分析。D SynComs成员的变化。
Cr和拟南芥来源的SynComs在任一宿主上形成了分类上相似的群落
把Cr（IPL）和拟南芥（IRL）来源的可培养菌中共有的科，配对挑选，共9个科。即Cr来源的9个，拟南芥来源的9个。把 IPL IRL或混合的(IPL + IRL) SynComs，接种到无菌Cr或拟南芥种子。五周后，发现菌和植物生长参数基本没有变化（附图）。混合的SynComs分析发现，Cr和拟南芥装配不同的群落，且和未种植的土壤区分开（图5A）。第二和第三主成分发现了和土壤中同样的规律（图1C），即藻际和根分不开（图5B）。科水平，所有的SynComs的分析表明根和藻际形成了不可分开的微生物群落，不管它们的宿主来源如何（图 5B）。Cr来源的菌株可以在拟南芥定殖（48.32%相对丰度），拟南芥根来源的菌株也可以在Cr（42.94%）和土壤定殖（25.70%）（图 5C，D）。然而宿主偏好性定殖还是存在的，即Cr来源的菌在Cr有更好的定殖，拟南芥同理（图5D）。
图5 A 菌株水平β多样性分析。B Bray-Crutis距离的CPCoA分析（第二三轴，aggregated at the bacterial family level）。C土壤和D液体无菌系统中菌株相对丰度。
物理上的接近是藻际群落定殖和促进藻类生长必需的
为了研究可扩散光合产物和物理接近多大程度影响藻际群落定殖以及与宿主互作，作者利用了下图所示装备进行了实验。两个隔室之间有一个0.22μm的PVDF膜，化合物可以透过，但细菌不能。培养基是无碳的。简写含义：Cr cultures (C), bacterial SynComs (SC)。
7天后，发现SC和C+SC与最初接种群落明显区分开，且它们互相也是明显区分开的（图6A，颜色表明）。C+SC|- vs. SC|C的区别主要体现在前者富集Sphingomonadaceae 和 Comamonadaceae，而Pseudomonadaceae减少。这个前面土壤、微宇宙和SynCom 液体实验是类似的：没有Cr存在时，Pseudomonadaceae变得丰富。
C + SC群落还和邻近的群落有关（图6B），此外Cr在邻近隔室存在就足以使SC发生改变（图6C）。作者推测可能是可扩散的光合产物或Cr改变了培养基状态如pH。Cr和SC直接接触与否也会影响邻近隔室SC的装配（SC|C vs. SC|C + SC，图6C），这可能是由邻近隔室和Cr一起培养的SC竞争了光合产物或者是SC和Cr直接接触引起Cr生理变化引起的。
图6 A 涵盖所有样品的Bray-Curtis为基础的菌株水平的Constrained PCoA。B和C代表部分样品的Constrained PCoA。D和E分别代表叶绿体荧光和藻类细胞密度为指标的Cr生长情况。
关于Cr的生长变化：SC对Cr有积极作用（C|SC vs. C|-），如果Cr隔壁是SC+C则促进效应最明显（图6C，D），可能是由于物理接触效应对藻类有积极影响。C + SC组的叶绿体含量和细胞数在隔壁不存在其它微生物时是最高的（图6C，D），可能是隔壁如果存在微生物就会竞争营养。综合表明，物理接近效应是藻际微生物装配和Cr生长所必需的。
通讯作者简介
Ruben Garrido-Oter，西班牙人，2017年计算生物学博士毕业就任Group Leader。主要利用计算生物学方法研究光合生物（陆生植物和陆生微藻）相关微生物群落的生态和进化原则。聚焦于两个问题：1）微生物群落建立、稳定和动态的原则；2）在多方微生物-微生物互作、宿主-微生物互作选择的情况下，群落情境下的适应是如何发生的。
在Nature，Cell，Nature子刊，Cell子刊等发表论文48篇，总被引5271次，H指数21。https://scholar.google.com/citations?user=TSS4lqQAAAAJ&hl=en
另外他们在招PhD和postdoctoral scientists，感兴趣的联系: garridoo@mpipz.mpg.de
主页：https://www.mpipz.mpg.de/4764825/members
Durán, P., Flores-Uribe, J., Wippel, K. et al. Shared features and reciprocal complementation of the Chlamydomonas and Arabidopsis microbiota. Nat Commun 13, 406 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-28055-8
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