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编译：微科盟葡萄不加冰，编辑：微科盟居居、江舜尧。
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导读
土壤有机碳(SOC)是全球生态系统中重要的碳库，受到包括施肥在内的各种农业措施的影响。过量施氮是茶园系统中一项重要的田间管理措施。然而，施氮对土壤有机碳的影响机制，特别是微观机制尚不清楚。本研究利用宏基因组学方法，在不同施氮量的茶园中探讨了施氮对碳循环基因、SOC降解酶以及表达这些酶的微生物的影响。结果表明，施氮显著改变了C循环基因和SOC降解酶的丰度，尤其是与不稳定碳和难降解碳降解相关的基因。此外，在不同施氮量下，表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落存在显著差异。在门水平上，参与C降解的微生物类群高度相似且丰富，而在属水平上，只有特定类群表现出不稳定碳和难降解碳降解；这些SOC降解微生物在施氮条件下显著富集。冗余分析(RDA)表明，土壤和凋落物性质对SOC降解群落有显著影响，土壤pH和DOC、凋落物生物量和总多酚(TP)影响显著。随机森林(RF)算法显示，土壤pH值和优势类群能有效预测β-葡萄糖苷酶的丰度，而土壤pH值和DOC、修剪凋落物TP和高丰度微生物类群能有效预测几丁质酶的丰度。本研究表明，长期施氮对SOC降解酶以及表达这些酶的微生物产生了显著的积极影响，从而对多年生茶园生态系统中的土壤碳储存产生潜在影响。
图文摘要
论文ID
原名：Metagenomics reveals N-induced changes in carbon-degrading genes and microbial communities of tea (Camellia sinensis L.) plantation soil under long-term fertilization
译名：宏基因组学揭示长期施肥下茶园土壤碳降解基因和微生物群落的氮诱导变化
期刊：Science of the Total Environment
IF：10.753
发表时间：2022.10
通讯作者：马立锋，阮建云
通讯作者单位：中国农业科学院茶叶研究所
DOI号：10.1016/j.scitotenv.2022.159231
实验设计
结果
1 土壤C循环功能基因
基于CAZyme数据库，共鉴定出196个频率>75%的C循环基因，这些基因对施氮有显著反应(p<0.05)。PCoA分析表明，在不同施N量下，C循环基因存在显著差异(R2=0.77，p<0.001)。施氮显著改变了C循环基因的多样性；然而，这些C循环基因的丰富度和多样性指数却呈现相反的趋势。随着施氮量的增加，C循环基因的Chao1指数降低，Shannon指数降低。此外，二次回归解释了C循环基因多样性指数与施N量之间的关系。
根据C循环基因的具体功能，将其分为六类，包括糖苷水解酶(GHs)、糖基转移酶(GTs)、碳水化合物酯酶(CEs)、辅助活性(AAs)、多糖裂解酶(PLs)和碳水化合物结合模块(CBMs)；这六种基因组的相对丰度由高到低依次为：GHs>GTs>CEs>AAs>CBMs>PLs (图1)。详细分析发现，施氮显著改变了6种功能基因的相对丰度；随着施氮量的增加，大多数基因的丰度显著降低，只有GHs和AAs的丰度增加。同时，二次回归描述了施N量与C循环基因之间的关系(R2=0.63–0.76，p<0.01)，CBMs和PLs除外，因为与施N量的相关性较小。
随后通过相关分析探究土壤和修剪凋落物特性与C循环基因丰度和多样性指数之间的关系，结果表明，除PLs外，这些C循环基因与土壤pH和DOC之间存在较强的相关性；这些基因与土壤pH值呈负相关，与DOC呈正相关。GHs、GTs、CEs、AAs和CBMs与修剪凋落物的生物量呈正相关；但PLs与修剪凋落物的性质没有显著相关性。在多样性指数中，C循环基因的Chao1指数与土壤pH、TP呈正相关，而Shannon指数与土壤pH呈负相关，与DOC呈正相关。多样性指数与其他修剪凋落物特性没有显著相关性。
图1 长期施氮对编码糖苷水解酶(GHs)、糖基转移酶(GTs)、碳水化合物酯酶(CEs)、辅助活性(AAs)、碳水化合物结合模块(CBMs)和多糖裂解酶(PLs)的微生物基因相对丰度的影响。(A，左图)箱线图显示了氮肥施用量对六组C循环基因影响的方差分析结果；趋势线(B，右图)显示了回归曲线，表明六组C循环基因与施N量之间的关系，灰色阴影表示95%置信区间。小写字母表示不同施氮量之间C循环基因组的显著差异(p<0.05)。
2 参与SOC降解的功能基因
在6种C循环基因中，GHs的相对丰度最高(37.43%；图1A)。我们确定了71个编码GHs的基因，它们参与SOC降解；但本研究中只列出了前20个基因。详细分析表明，施氮显著增加了GHs基因的丰度(图2)。此外，GH基因与土壤pH和DOC显著相关；GHs与土壤pH呈负相关，与DOC呈正相关。然而，在GHs和其他土壤特性之间未检测到显著相关性。在修剪凋落物性状中，生物量与GH家族的大部分基因呈正相关，而TP与少数基因呈负相关。GHs与其他修剪凋落物性状无显著相关性。
图2 不同施氮量下茶园土壤中与SOC降解有关的C循环糖苷水解酶基因(GHs)丰度的变化。气泡图以每个样本的reads表示GH家族的绝对丰度(A)。显示了20种最丰富的GH。箱线图显示了施氮量对β-葡萄糖苷酶(B)和几丁质酶(C)基因丰度影响的方差分析结果。小写字母表示不同施氮量之间的显著差异(p<0.05)。
3 参与SOC降解的微生物群落的多样性和组成
碳降解是导致土壤碳流失的主要过程。本研究重点研究GH家族中的两个关键基因GH3和GH18，分别编码β-葡萄糖苷酶和几丁质酶，降解不稳定和难降解的C(图2)。β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的绝对丰度都随着施氮量的增加而显著增加(图2)。β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的相对丰度与土壤pH、DOC和修剪凋落物的生物量和TP显著相关，但与任何其他土壤和凋落物性质无关。
PCoA分析表明，随着施氮量的增加，表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落存在显著差异。携带β-葡萄糖苷酶和几丁质酶编码基因的微生物群落结构(属水平)在不同施N量之间存在显著差异(PERMANOVA检验：R2=0.65，p<0.001，R2=0.59，p<00.001；图3)。在该图中，第一轴和第二轴分别解释了表达β-葡萄糖苷酶(图3A)和几丁质酶的微生物群落总变异(图3B)的72.55%和64.43%。低N处理(N0和N119)和高N处理(N285和N569)下的土壤样品沿第一坐标轴明显分离。进一步分析表明，在不同施N量下，表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落Chao1指数没有差异。施氮量对Shannon指数有显著影响；表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落的Shannon指数随着施N量的增加而显著降低。同样，二次回归仅拟合不同施N量的Shannon指数。
分类注释确定了在门水平上表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的类似分类群(图4A，B)。携带这些基因的优势菌门为酸杆菌门(34.92% vs. 36.09%)、变形菌门(27.71% vs. 25.48%)、放线菌门(19.37% vs. 20.61%)、绿弯菌门(5.68% vs. 4.26%)和拟杆菌门(4.78% vs. 3.13%)，共占微生物总数的92.46%-89.57%。此外，施氮量在门水平上显著影响表达β-葡萄糖苷酶的微生物类群；七个细菌门的丰度随着施氮量的增加而增加。然而，施氮量并不影响Chloroflexi、Armatimonadetes、candidate_division_NC10的丰度。与表达β-葡萄糖苷酶的微生物群落相似，8种表达几丁质酶的微生物类群的丰度随着施氮量的增加而显著增加；然而，绿弯菌门和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)对施氮没有反应。
随后在属水平上对表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的相关微生物进行了分类注释，确定了25个表达β-葡萄糖苷酶的菌属，相对丰度>1%。按相对丰度降序排列的前五个分类群是Silvibacterium、Acidobacterium、Streptomyces、Rhodanobacter和Thermogemmatispora(图4C)。在前10个类群中，Thermogemmatispora和Ktedonobacter在施氮量之间没有显著差异，而其他8个类群则随着施氮量的增加而增加。共有13个相对丰度>1%的属与几丁质酶相关。按降序排列的前五个分类群依次是Rhodanobacter、Streptacidiphilus、Stenotrophomonas、Acidobacterium和Ktedonobacter(图4D)。除Ktedonobacter外，其他9个分类群随着施氮量的增加而增加。
图3 基于Bray-Curtis距离的表达β-葡萄糖苷酶(A，左图)和几丁质酶(B，右图)的属水平群落组成的主坐标分析(PCoA)。PCoA 1和PCoA 2解释的变化显示为沿轴的百分比值。采用置换多元方差分析(PERMANOVA)确定施氮量对功能群落结构的显著影响。
图4 在四种长期施氮量下，茶园土壤中表达β-葡萄糖苷酶(A，C；左图)和几丁质酶(B，D；右图)的前10个微生物类群在门(A，B；上图)和属(C，D；下图)水平上的相对丰度。
4 参与SOC降解的微生物群落与土壤和修剪凋落物特性的关系
本研究使用RDA评估土壤和修剪凋落物特性对表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶群落的影响。RDA的前两个坐标轴分别解释了表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物55.30%和46.50%的变异(图5A，B)。PERMANOVA分析发现，土壤pH值(R2=0.56，p=0.001和R2=0.52，p=0.001)和DOC(R2=0.34，p=0.01和R2=0.31，p=0.002)显著影响表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落(表1)。在修剪凋落物的特性中，只有生物量(R2=0.24，p=0.016和R2=0.27，p=0.003)和TP(R2=0.22，p=0.0119和R2=0.211，p=0.030)显著影响表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的群落(表1)。此外，利用VPA分析土壤和修剪凋落物特性对土壤β-葡萄糖苷酶和几丁质酶表达微生物群落的相对贡献。结果表明，土壤pH、DOC、生物量和TP显著影响功能微生物群落结构；土壤性质(pH和DOC)在很大程度上解释了表达β-葡萄糖苷酶(28.46%)和几丁质酶(22.64%)的微生物群落的变化，而修剪凋落物特性(TP和生物量)的变化率很低(<1%)(图5C，D)。这些观察结果表明，土壤和修剪凋落物特性显著影响表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落(分别为20.73%和25.81%的变异)。
最后，皮尔逊相关分析表明，只有土壤pH和DOC与表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物类群显著相关；然而，这两个性质显示了相反的相关性。土壤pH值与表达β-葡萄糖苷酶(7门7属)和几丁质酶(8门7属)的微生物显著相关。土壤DOC与表达β-葡萄糖苷酶的5门6属和表达几丁质酶的4门3属微生物显著相关。在修剪凋落物的特性中，生物量与表达β-葡萄糖苷酶的类群(3门5属)和表达几丁质酶的(4门3属)类群显著相关，而TP与表达β-葡萄糖苷酶的2门5属微生物和表达几丁质酶的4门3属微生物显著相关。其他土壤和修剪凋落物特性与表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物类群的相关性较弱。
图5 冗余分析(RDA)和方差分解分析(VPA)显示了表达β-葡萄糖苷酶(A，左图)和几丁质酶(B，右图)的群落组成与土壤和修剪凋落落物特性之间的关系。采用置换多元方差分析(PERMANOVA)检验环境因素对功能性微生物群落的影响，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。对于VPA，土壤和修剪凋落物特性是影响RDA图中表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落的重要变量。
表1 置换多元方差分析(PERMANOVA)结果。
注：粗体文本表示PERMANOVA检验的统计显著性。
5 预测β-葡萄糖苷酶和几丁质酶丰度的驱动因素
本研究使用RF模型筛选了影响β-葡萄糖苷酶和几丁质酶丰度的主要土壤和修剪凋落物特性以及关键微生物类群(图6)。β-葡萄糖苷酶和几丁质酶模型均显示出良好的预测效率(R2=0.78，p<0.01，R2=0.65，p<0.01)。在β-葡萄糖苷酶模型中，只有土壤pH被确定为土壤特性中显著影响β-葡萄糖苷酶丰度的关键变量。同时，在属水平的10个分类群中有6个被鉴定为关键微生物类群，即Silvibacterium、Acidobacterium、Streptomyces、Rhodanobacter、Caulobacter和Streptacidiphilus。然而，修剪凋落物特性不影响β-葡萄糖苷酶的丰度。在几丁质酶模型中，土壤pH、DOC和修剪凋落物TP含量对几丁质酶丰度的预测精度较高(图6)；该模型还鉴定了5个微生物类群，它们显著影响几丁质酶的丰度。
图6 随机森林回归模型显示了影响β-葡萄糖苷酶(A)和几丁质酶(B)基因丰度的关键因素。MSE表示“均方误差”，R2表示模型的拟合优度。条形图上方的星号表示这些因素对β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的丰度有显著影响，*p<0.05，**p<0.01。
讨论
1 长期施氮对有机碳降解基因的影响
在本研究中，长期施氮显著影响茶园土壤中的C循环基因。C循环功能基因的Chao1指数随着施氮量的增加而降低，而Shannon指数增加，表明施氮条件下土壤中与C降解相关的微生物多样性增加。此前，Trivedi等人也报告称，施N显著改变了功能基因的组成；随着施氮量增加，amyA、glucoamylase、ara、xylanase、cellobiase和endochitinase等C降解基因的丰富度和多样性降低。然而，本研究发现，有机C降解基因(GHs)的相对丰度随着施N量的增加而增加(图1)，这与之前的meta分析一致，即随着N施用量的增加，碳循环酶β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)和β-D-cellobiosidase(CBH)的活性增加。这些结果表明，施氮不利于SOC积累。同样，Luo等人也发现，由于C降解酶的活性显著增加，施氮加速了青藏高原草原生态系统中的SOC损失。此外，本研究发现，施氮条件下有机碳合成基因(如GTs)的相对丰度大幅下降(图1)，这与我们之前关于高施氮条件下有机碳含量下降的发现一致，这可能也是由于修剪凋落物的正启动效应。因此，研究结果表明，外源C输入具有正启动效应，导致SOC积累减少。
详细分析表明，前20个SOC降解基因的相对丰度随着施N量的增加而显著增加(图2A)，表明这些基因与N输入呈正相关。在SOC降解基因中，β-葡萄糖苷酶和几丁质酶是专门降解不稳定和难降解C的关键酶。基于KEGG数据库的分析发现，β-葡萄糖苷酶的活性是几丁质酶活性的十倍(图2B，C)，表明活性C是茶园土壤中的主要C成分。这一观察结果与我们最近的结果一致，即在长期施肥条件下，茶园土壤中的碳储量相对较低，即使在归还修剪凋落物后也是如此。返回茶园土壤的大量修剪凋落物含有活性碳，可被土壤微生物降解。此外，β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的丰度随着施氮量的增加而显著增加(图2B和C)，表明施氮促进了不稳定C和难降解C的分解，加速了SOC的损失，这与高氮条件下SOC的减少相一致。这些结果表明，在茶园系统中，修剪后的茶树凋落物掺入导致茶园系统中SOC积累减少，特别是在过量施氮的情况下。
2 长期施氮对有机碳降解微生物群落的影响
微生物是生物地球化学循环的重要驱动因素。本研究重点关注与不稳定和难降解C降解相关的β-葡萄糖苷酶和几丁质酶表达微生物群落(图3和图4)。在茶园土壤中，长期施氮显著改变了表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落组成，尤其是在低氮(N0和N119)和高氮(N285和N569)条件下(图3)。此外，不同施氮量下葡萄糖苷酶和几丁质酶表达群落存在显著差异(图3)。在高氮施用量下，β-葡萄糖苷酶和几丁质酶表达微生物的多样性显著降低。本研究中观察到的微生物变异与草地、森林和农田等其他生态系统中微生物群落对施氮的响应一致，这可能是由于不同施氮量下土壤氮有效性的变化。根据寡营养-共生营养理论，特定微生物对土壤氮有效性的反应不同。在本研究中，氮引起的功能性微生物多样性的减少可能是由于寡营养群落。
在门水平上，大多数表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物数量丰富且相似(图4A、B)，表明这些优势微生物类群可能属于执行大多数生态功能的栖息地普遍类群。因此，优势菌门酸杆菌门、变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和芽单胞菌门可能是最广泛的分类群。这一发现与之前的研究一致，即五个最丰富的细菌门都是普遍的，占微生物总丰度的四分之三以上。在表达β-葡萄糖苷酶的微生物群落中，Armatimonadetes和疣微菌门是负责分解不稳定C的特定微生物类群，而在表达几丁质酶的微生物群中，浮霉菌门、子囊菌门和硝化螺旋菌门是负责分解难降解C的特定菌群。这些特异性微生物可能是栖息地特有的，通常数量较少。这些观察结果表明，栖息地共有类群和特有类群都具有生态功能。换言之，丰富和稀有的微生物群落都具有重要的生态功能。
同时，在属水平上，降解不稳定和难降解C的微生物类群差异很大，表明大多数生态功能是由更高分类学水平的特定类群完成的。Silvibacterium、Acidobacterium、Streptomyces和Ktedonobacter是与不稳定和难降解C降解相关的特定微生物属(图4C、D)。此外，表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物的相对丰度在属水平上存在显著差异；高丰度的微生物类群进行不稳定C降解，而低丰度的微生物类群则进行难降解C降解(图4C，D)。这些结果表明，微生物在很大程度上依赖于底物的差异来表现特定的生态功能。然而，应该指出的是，由于单个菌株可以执行多种生态功能，因此需要进一步分析功能微生物类群，特别是在更高的分类学水平(即物种水平)上。此外，我们还发现功能分类群与施N量之间有很强的正相关关系；这些功能分类群属于共生营养类群。结果表明，施氮促进了茶园土壤中功能类群的生长繁殖，促进了土壤有机碳的降解，降低了土壤有机碳含量。
3 施氮条件下茶园土壤有机碳分解相关功能基因和微生物群落的驱动因素
各种生物和非生物因素在构建功能性微生物群落中至关重要。本研究的RDA结果表明，土壤pH值是影响茶园土壤中表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落的重要因素(图5)。这一观察结果与Dai等人报道的土壤pH是调节土壤C循环的关键因素，包括C循环基因和相关功能群落的研究结果一致。此外，有证据表明，土壤pH值是调节微生物生长的关键因素；微生物在中性环境中生长；因此，酸性和碱性条件会抑制它们的生长和繁殖。在本研究中，有机碳降解基因和微生物群落与土壤pH呈负相关，这与Dai等人的研究结果一致，表明相对较低的pH值可能有利于SOC降解。
此外，土壤DOC显著影响C降解基因和表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落(图5)。DOC是C的一种不稳定形式，很容易被微生物分解和利用。在分解过程中，DOC是细菌生长和活动的直接能量来源，其可用性影响营养物质的转化，包括氮、磷和硫循环。DOC被广泛认为是土壤微生物的能量和营养来源。多项研究表明，DOC对土壤生物特性的影响大于其他物理化学特性。此外，与Zhong等人一致，在不同施氮量下秸秆降解过程中，DOC和木质素解释了较高的微生物群落变异率。
除土壤特性外，修剪凋落物特性也显著影响SOC降解酶、β-葡萄糖苷酶和几丁质酶表达微生物群落(图5)。植物生物量是微生物的主要能源，它提供SOC等优质基质，从而增加土壤微生物群落的数量。Chen等人发现土壤细菌多样性与植物生物量呈正相关。此外，多酚显著影响β-葡萄糖苷酶和几丁质酶表达微生物群落(图5)，类似于对土壤微生物群落的影响。研究表明，作为碳源的多酚对各种土壤过程(如硝化作用)有很大影响。多酚对土壤碳循环的影响已有较多报道。例如，多酚刺激凋落物分解速率，影响土壤腐殖质形成和养分释放模式，并直接或间接改变微生物群落。多酚还能控制其他大量营养素(如磷和硫)，以及微量营养素，如铁、铜、锌和锰。多酚对土壤氮含量有积极或消极影响，具体取决于特定的酚类化合物和微生物活性。因此，这些早期报道和当前的研究结果表明，在探索微生物群落的驱动因素时，还应考虑植物特性。
结论
在本研究中，长期施氮显著改变了茶园中表达β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的微生物群落。施氮显著提高了C循环基因的丰度，特别是β-葡萄糖苷酶和几丁质酶的表达。在门水平上相似的优势微生物类群和在属水平上的差异类群降解茶园土壤中不稳定和难降解C。进一步的随机森林模型表明，土壤pH和DOC、修剪凋落物的多酚含量以及发挥生态功能的优势类群是预测土壤中β-葡萄糖苷酶和几丁质酶丰度的重要变量。由此可见，施氮显著提高了茶园土壤SOC的降解能力，这反映在功能基因和微生物类群上，不利于SOC的积累。这些结果为从基因-酶-微生物角度探讨农业管理措施对土壤碳转化的影响提供了基础。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969722063306
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