发表时间：2023年4月23日
发表期刊：Gut Microbes
五年影响因子：11.724
发表单位：温州医科大学
第一作者：杨金奂，何其宽
通讯作者：陈钢，王怡
原文链接：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2023.2201159
研究背景
肝细胞癌（HCC）仍是最致命的恶性肿瘤之一，全球发病率和死亡率都在增加，每年导致超过700万人死亡。由于发病隐匿且缺乏精确预测的生物标志物，多数患者在诊断时已处于晚期，错过了手术治疗的最佳时机。尽管血清AFP水平和影像学检查是目前公认的肝细胞癌筛查手段，但仍需要开发更多的肝癌生物标志物，以提高肝癌的早期诊断效率。
近些年来，人们对肠道微生物群在各种癌症中的病因学作用的兴趣激增。研究表明不同病因的肝细胞癌（酒精性、肝炎病毒、非酒精性脂肪肝性和黄曲霉毒素等）通常伴随着微生物组的明显改变。例如，肝炎病毒感染可引起肠道屏障的结构变化，并增加微生物通过肠-肝轴的易位，导致粘膜免疫功能受损以及过度的长期免疫反应，从而导致肝脏疾病的发展，包括纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌。此外，口腔微生物群也被证明与消化系统疾病广泛相关，如口腔鳞状细胞癌、炎症性肠病、肝硬化等，提示部分肠道微生物可能从口腔迁移而来。特别是，肝硬化肝癌患者的口腔微生物组发生显着变化，有望将HCC与健康人群区分开来。然而，已有的研究仅关注口腔或粪便微生物组与HCC之间的联系，尚未有研究证实口腔菌群联合肠道菌群作为HCC诊断的生物标志物的可行性。
另一方面，近期的研究表明在几种癌症中发现存在肿瘤内特征性的微生物群，这些细菌存在于癌细胞和免疫细胞中并且可能来自于循环细菌。此外，还发现胰腺癌中的优势微生物变形杆菌与十二指肠的微生物组组成相似，这提示肠道细菌可能从肠道逆行侵入胰管。考虑到胆管在解剖结构上同样连通肠道和肝脏，且门脉系统也为细菌的血行转移提供了生理基础，故我们想进一步探究肝癌组织中是否存在肿瘤微生物群，以及其与肠道菌群的关系。
研究设计与发现
2.1
口腔菌群和粪便菌群均能有效区分肝癌患者和健康人群
本团队对前期收集的口腔菌群（59名HCC患者，120名健康对照）和肠道菌群（305名HCC患者，40名健康对照）数据单独进行分析，发现不论是口腔菌群还是肠道菌群，在HCC患者和正常人群中都存在显著差异，并且口腔和肠道菌群中链球菌属（Streptococcus）的差异最为显著。
图1.肝癌患者与健康人群的口腔、粪便菌群的多样性分析及差异分析
2.2
设计纵向验证队列
为了探究口腔菌群联合粪便菌群作为HCC诊断标志物的可行性，通过建立一个新的前瞻性队列来验证其效率。前瞻性队列的设计为口腔样本-粪便样本-肿瘤组织样本一一配对，包括91名HCC患者和124名健康对照人群，其中肿瘤组织样本为患者的一个子集，同时收集了乙肝患者的粪便样本。
图2. 队列设计示意图及前瞻性队列患者的基线特征
2.3
肝癌的发生过程中是否伴随菌群的持续变化
鉴于乙肝相关的肝细胞癌的疾病发展存在从乙肝感染、肝硬化、肝癌的持续过程，我们想进一步探究在疾病发展过程中微生物组的变化是否伴随疾病不同阶段的进展。通过对健康人群、乙肝非肝硬化患者、乙肝肝硬化患者、肝细胞癌患者的粪便菌群进行比较分析，发现链球菌、克雷伯菌属、志贺菌属、普雷沃菌属、粪杆菌属等多种微生物在疾病进展过程中出现菌群比例的渐序变化，其中链球菌在从健康到肝癌的发展过程中存在显著的积累效应。进一步通过BugBase工具比较疾病进展过程的微生物表型改变，发现厌氧、兼性厌氧和移动原件等表型存在一定规律的变化，提示可能与肠道缺氧和通透性改变有关。故通过检测血清ZO-1、内毒素水平和粪便钙卫蛋白进一步验证了HCC患者肠道通透性的改变。
图3. 不同疾病阶段的菌群变化和表型，以及肠道通透性的改变。
2.4
差异菌群与临床特征的相关性分析
为探究改变的微生物组与临床的相关性，进行了菌群-菌群的SparCC网络分析和菌群-临床指标的RDA分析，其中链球菌表现出与11种菌属存在正或负相关，并与肝病终末期评分（MELD）呈显著正相关。宏基因组KEGG分析发现HCC组多种氨基酸代谢处于活跃水平。
图4. 菌群-菌群，菌群-临床指标的相关性分析，粪便样本宏基因组KEGG通路分析
2.5
肿瘤组织存在驻留菌群并与口腔肠道菌群存在交集
随后我们对严格无菌采集的癌、癌旁及正常肝脏组织进行5R 16S rRNA测序，发现癌或癌旁组织均存在链球菌、志贺菌属、粪肠球菌等在内的微生物群（丰度＞1%）。通过IHC对G+和G-菌进行染色，并设计引物对包括链球菌在内的几个菌种进行FISH染色，进一步证实了肝癌内细菌的存在。
图5. 无菌采集的癌、癌旁和正常肝脏的组织微生物测序结果，IHC及FISH染色证实菌群的存在
2.6
前瞻性队列验证口腔联合肠道菌群诊断HCC的效率
基于匹配样本的前瞻性队列的菌群测序结果可知，肝癌患者存在口腔-肠道-肿瘤的多个生态位菌群，这为其作为诊断标志物提供了更加确切的生理基础。因此我们通过随机森林算法提取了回顾性队列中对分组贡献最大的10个口腔菌属和9个粪便菌属，并在前瞻性队列中进行验证，其中口腔菌群的AUC=0.7971，粪便菌群AUC=0.8084，口腔+粪便AUC=0.9405，口腔+粪便联合AFP后AUC达0.9811。
图6. 回顾性队列提取的特征菌群组合在前瞻性队列中的验证结果
综上，这是目前第一项表征肝癌患者口腔-肠道-肿瘤微生物组的研究，发现了在多个生态位共有的细菌，提示肝癌患者可能存在的细菌移位或串扰，为后续进一步揭示微生物在肝癌病因学方面的作用机制提供了一个视角。此外，纵向队列的验证也证明了口腔菌群联合粪便菌群在鉴别HCC与健康人群方面的潜力，未来有望进行跨地域、多人种的验证进一步证实其适用性。
致谢杭州联川生物技术股份有限公司为本研究提供肿瘤组织微生物组检测支持。
第一作者
杨金奂
温州医科大学 博士研究生
研究方向主要为肝癌肿瘤内菌群影响肝癌发生发展的机制、肠道菌群及其代谢物影响肝癌肌少症中骨骼肌炎症的机制研究等。以第一作者身份在J Cachexia Sarcopenia Muscle、Gut Microbes等杂志发表SCI论文6篇，申请专利1项，担任美国营养学会会员。
何其宽
温州医科大学 博士研究生
研究方向主要为菌群微生物-肝癌免疫微环境调节机制，目前以第一作者在Cancer cell international，Gut Microbes等国际期刊发表学术论文8篇，其中SCI收录5篇。
通讯作者
陈钢
温州医科大学附属第一医院肝胆胰外科主任医师/教授/博士生导师，浙江省肝胆胰肿瘤生物工程交叉国际联合实验室主任
致力于肝胆胰肿瘤的基础与临床转化研究多年，主要研究方向为：1.肠道微生物多组学与肝胆胰肿瘤微环境交互作用研究；2.人工智能在肝胆胰肿瘤精准治疗中应用研究；3.精神心理问题与肝胆胰肿瘤共病机制和干预策略研究等。近年来以第一或者通讯作者Cancer Research、Clinical Cancer Research、Oncogene、J cachexia sarcopenia muscle等国际权威杂志发表论文50余篇。欢迎广大优秀学子及临床、科研人员报考硕、博研究生及博士后合作研究。
王怡
温州医科大学循证医学与临床流行病学研究中心副主任，公共卫生学院副教授，硕士生导师，梅奥诊所学院健康科学系合作研究员
主要研究方向为癌症流行病学，遗传、分子、药物遗传流行病学，癌症患者的健康需要和生活质量的心理社会评估等。目前以第一或通讯作者在JAMA、Clinical Cancer Research、European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging，Cell Death and Disease，Journal of Cachexia,Sarcopeniaand Muscle，Oncogene等国家高水平杂志发表论文30余篇。
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