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针对益生菌产品的单细胞快速鉴定、原位活力和活性检测以及基于基因组的来源追踪
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研究论文
● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.117
● 2023年5月25日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所徐健团队、中国食品发酵工业研究院姚粟团队和青岛东海药业有限公司崔云龙团队在 iMeta 在线联合发表了题为 “Single-cell rapid identification, in situ viability and vitality profiling, and genome-based source-tracking for probiotics products” 的文章。
● 本文研发了一种免培养、单细胞水平、表型组-基因组结合的策略，称为单细胞鉴定、原位活力和活性检测以及溯源（SCIVVS），用于快速评估益生菌产品的质量。
● 第一作者：张佳、任立辉、张磊、公衍海
● 通讯作者：徐健（xujian@qibebt.ac.cn）、姚粟（su.yao@china-cicc.org）、崔云龙（cuiyunlong@qdeastsea.cn）
● 合作作者：徐腾、王晓航、郭成、翟磊、于学健、李映、朱鹏飞、陈荣泽、荆晓艳、荆功超、周世奇、徐铭悦、王琛、牛长凯、葛媛媛、马波、尚改双
● 主要单位：青岛生物能源与过程研究所、青岛东海药业有限公司、中国食品发酵工业研究院、青岛星赛生物科技有限公司、山东省能源研究院、青岛新能源山东省实验室、中国科学院大学、中国海洋大学、中国联合网络通信股份有限公司青岛分公司
亮 点
● 本文研发了一种免培养、单细胞水平、表型组-基因组结合的策略，称为单细胞鉴定、原位活力和活性检测以及溯源（SCIVVS），用于快速评估益生菌产品的质量；
● SCIVVS可实现平均高达93％的鉴定准确率，并精准量化细胞活力、代谢活力以及细胞异质性；
● 同时，针对乳酸杆菌、双歧杆菌或链球菌等不同种益生菌，均能产出高质量的单细胞基因组（覆盖度可高达99.4%），从而完成精准溯源；
● SCIVVS比传统方法快20倍，而成本仅为传统方法的1/10，能自动化、一站式地完成产品中每个物种的细胞活力、细胞异质性测量；
● SCIVVS是一种新的技术标准，可以支撑现有益生菌和其他活细胞产品的质检、过程监测以及知识产权保护。
摘 要
益生菌产业市场规模的的快速扩大要求快速、灵敏、全面且低成本的质量评估方法。本研究介绍了一种无需培养、单细胞水平、表型组-基因组结合的策略，称为单细胞鉴定、原位活力和活性检测以及溯源（SCIVVS）。基于21种法定益生菌物种的参考SCRS数据库，可以根据单细胞拉曼光谱（SCRS）的指纹区域的不同，直接从益生菌产品出发，以93％的准确率完成菌种级别的鉴定；根据C-D峰可以准确量化细胞活力、代谢活力以及细胞异质性；对于溯源，可以利用拉曼激活单细胞分选技术（scRACS-Seq），精确的将单个细胞的基因组组装，可达到约99.40％的基因组覆盖率。最后，我们验证了自动化采集的SCIVVS一体化工作流程，整个过程除测序外只需五个小时就可以完成质检。SCIVVS比传统方法快20倍，而成本仅为传统方法的1/10，能自动化、一站式地完成产品中每个物种的细胞活力、细胞异质性测量，有望形成新的技术标准。
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全文解读
引 言
益生菌是“在摄入足够的量，会给宿主带来健康益处的一类活性微生物”。益生菌的消费已成为全球趋势，市场上已经有许多与健康有关的益生菌产品或正在开发中。对于这些活细胞产品的生产、消费和市场监管，其质量评估至关重要。益生菌产品必须符合质量、安全和功能方面的标准，否则不符合标准的产品会导致有益功能的丧失甚至危害健康。此外，产品声明中核心质量参数的缺失、不完整或不准确将有碍消费者的知情权，还将阻碍政府机构和法规进行监管。益生菌产品的核心质量参数由以下4个方面组成：（i）活细胞数，（ii）菌种鉴定（ID），（iii）原位活力，（iv）溯源。然而，目前行业中广泛应用的方法有很大的局限性。因此，为规范愈发庞大的益生菌市场，亟需建立一种快速、灵敏、精准、全面且普适的方法来评估益生菌产品的核心质量参数。
然而，每个核心质量参数的质检都存在挑战。(i)“活细胞数”，可以衡量细胞的整体活力，传统方法大多数基于培养进行计数，如平板菌落计数和琼脂扩散法；但这些常用的方法存在灵敏性差和费时费力的缺点。而且，平板菌落计数法通常是指的单菌落数而非单细胞数，而且无法统计亚致死、受损、抑制、休眠或不活跃状态的细胞数。近年来兴起的细菌计数的非培养方法，其主要基于DNA技术，例如聚合酶链式反应（PCR）结合乙啶单偶氮苯（EMA）或丙啶单偶氮苯（PMA），通过死细胞中DNA停止扩增的原理计算活/死细胞数，但由于试剂成本高、操作复杂以及DNA提取效率的差异导致的准确性差，限制了其在工业中的广泛应用。
(ii)“菌种鉴定（ID）”，正确识别益生菌菌株是评估其益生菌安全性的先决条件之一。目前的检测方法主要是基于基因型分析鉴定技术包括16S核糖体RNA（16S rRNA）基因序列、核心基因组或全基因组多位点序列类型（MLST）、扩增片段长度多态性（AFLP）和基于全基因组单核苷酸多态性（SNP）等方法。除此之外，还有基于表型分析的方法，包括基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和串联质谱（MS/MS）等方法。然而，这些方法都是耗时、高成本和依赖培养的，这限制了其检测不可培养细胞的应用，而且需要长达七天的时间（对于生长缓慢的菌种甚至需要更长时间）。由于需要DNA提取、文库构建和总DNA测序，基于宏基因组学的方法是无需培养的，但由于耗时长和成本高等缺点，不适用于益生菌产品质检。此外，宏基因组学通常无法区分细胞的死活，也无法评估细胞的原位活力。因此，我们急需一种快速、低成本且可靠的益生菌菌株识别且可以评估其原位活力的方法。
(iii)“代谢活力”是一个非常重要的概念，用于衡量活细胞在原位的代谢活力的强度，与“活性”不同，活性通常指细胞是活或死。“代谢活力”是一个关键的质量参数，与益生菌的功能和健康益处直接相关。目前，荧光探针、流式细胞术（FCM）和装备有高质量图像采集和分析系统的荧光显微镜等方法可以用于评估益生菌产品的“代谢活力”。然而，这些方法的缺点包括耗材昂贵、操作复杂（特别是对于没有经验的操作者），以及具有侵入性和不准确的分析。特别是，活细胞在荧光显微镜或荧光染色剂的作用下，会影响细胞的“代谢活力”。此外，细胞壁和细胞膜等结构会影响荧光探针进入细胞，从而降低荧光染色的成功率并导致结果的准确性低。由于上述方法无法深入解析单个益生菌细胞的生理状态和代谢活动，具有很深的局限性。虽然“代谢活力”对产品功效至关重要，但尚未被广泛采用作为益生菌质检的评估指标。因此，我们需要一种快速、深度且可靠的方法，不仅仅检测“活性”，还能检测到“代谢活力”。
(iv)“溯源”是益生菌行业的一个重要需求，因为适当的知识产权（IP）保护商业菌株是创新的基石。许多益生菌菌株已被专利或保护，声称拥有这些权利的公司可以排除其他公司在商业产品中使用它们。此外，由于基因交换可能会将意外或甚至有害的元素（如噬菌体或抗菌素耐药基因）引入原始菌株，因此应该监测益生菌菌株的基因组变化。因此，“溯源”不仅对IP保护很重要，也对产品的安全同样重要。为了准确可靠地追踪产品中的菌株，完整的基因组序列是检验的金标准，但测序结果通常需要长达几周的周期，因为在基因组测序前，通常需要基于培养分离目标菌株获得足量的纯培养物。
最后，除了以上方法所述的局限性之外，如何建立一个集成和易于自动化的平台也是关键挑战，自动化的平台可以确保流畅高效地完成所有质检任务。目前，每个核心质量参数的检测需要使用不同的仪器，例如用于活细胞计数需要培养箱，菌种鉴定需要使用质谱仪，检测代谢活力需要使用流式细胞仪，以及用于溯源的测序仪，因此工作流程的集成和自动化十分困难。相比之下，拥有一个可以同时处理多个质检任务的集成平台有助于工作流程自动化并降低成本等优势。
拉曼组/元拉曼组的定义为，从细胞群体或群落中获取若干细胞的单细胞拉曼光谱（SCRS）的集合，作为单细胞水平的代谢表型，无需培养和标记，可以快速完成微生物种类的鉴定并定量检测代谢活力（通过跟踪D2O摄入；死细胞没有代谢活动，因此不摄入D2O）。此外，通过开发拉曼激活细胞分选和测序（RACS-Seq）技术，从各种类型的微生物组样本中精准的获取表单细胞水平的代谢表型及其相对应的高覆盖度基因组信息。
因此，我们提出了一种无需标记、单细胞精度、基因组-表型组结合的策略，利用单细胞拉曼光谱和基因组测序的互补优势，称为单细胞鉴定、原位活力和活性检测与溯源（SCIVVS），并以益生菌（包括乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌）为例进行了验证。在SCIVVS中，使用D2O标记的单细胞拉曼显微光谱技术，直接从产品中提取单个细胞进行总活细胞计数、菌种鉴定和物种水平的原位活力和活性检测，而RACS-Seq（scRACS-Seq）则仅需一个细胞就可以进行基于全基因组进行来源追踪。通过检测实际的益生菌产品来评估SCIVVS技术，结果表明SCIVVS比传统方法快20倍，成本仅为传统方法的1/10，能自动化、一站式地完成产品中每个物种的细胞活力、细胞异质性测量以及高精准度的溯源。因此，SCIVVS是一种新的技术标准，可以改变当前益生菌和其他活细胞产品质检、过程监测和知识产权保护。
结 果
SCIVVS策略概述：快速、全面评估益生菌产品质量
针对益生菌产品，传统方法的质检流程通常由以下四个部分组成（见图1A）：（i）基于平板计数法进行活菌计数，需要至少三天；（ii）基于培养方法进行菌株的分离，然后进行生理生化鉴定，需要四天时间；（iii）从平板中分离纯化的纯培养物进行的荧光活力检测；（iv）通过纯培养物进行基因组测序进行溯源。以上全部过程都依赖于培养。因此，即使不计算测序所需时间（这取决于所选择的测序平台，时间差别很大），该过程通常需要至少一周时间。
相比之下，SCIVVS由三个顺序步骤组成，从提取的活细胞产品中开始，以一种无需培养的方式进行（见图1B）：（i）将益生菌细胞在100% D2O MRS液体培养基中孵育3小时；（ii）自动化采集D2O标记的SCRS，统计总活细胞计数、ID和物种水平的原位活力和活性；（iii）分选单个细胞，进行多位点扩增（MDA）和全基因组测序（通过scRACS-Seq）。由于不需要基于培养，因此可以在5小时内获得总活菌数、ID和物种水平的原位活力和活性（而来源追踪的时间取决于测序平台）。
图1. SCIVVS工作流程用于直接从商业益生菌产品中以精确的一个细胞分辨率进行活菌总数计数、快速鉴定、原位活力测试和溯源
（A）基于培养的传统方法。（B）免培养、单细胞水平的SCIVVS方法。
在SCIVVS中直接从益生菌产品中测量总活细胞计数
由于活细胞进行代谢会摄入D2O从而形成C-D峰，其强度与细胞的活力呈正相关（通过C-D比率或CDR），基于D2O标记的拉曼光谱法，可用于益生菌产品的活细胞计数，其中细胞的代谢活性（MAL）用于指示细胞的状态是活或死（图S1）。为了验证这个方案，我们选择一个适当的D2O浓度，在该浓度下可以通过MAL值量化D2O摄入量来准确的判断细胞的“代谢活力”。以含有植物乳杆菌的单一菌株的益生菌产品MPP-A作为测试（表S1）。在不同的D2O浓度（0%，25%，50%，75%，100%）的每个样品采集约100个细胞的SCRS进行比较。在每个D2O浓度下，活细胞由于进行代谢合成新的生物分子的过程会形成C-D峰（2040 cm-1-2300 cm-1），具有代谢活性细胞与D2O的结合比例随孵育时间成比例增加（图2A）。此外，100% D2O 孵育1小时活细胞的比例为22.89 ± 0.04%，3小时活细胞的比例达到93.88 ± 0.03%，与活细胞摄入D2O的时间一致。100%D2O MRS孵育3小时后，具有代谢活性细胞与D2O的结合比例不再增加（图2A）。
图2. 单细胞水平下基于SCRS的MPP-A总活菌计数
（A） 在不同时间不同浓度的MPP-A的D2O MRS介质中氘掺入的强度。标记0、1、2、2.5、3、3.5和4小时的活细胞百分比。（B）基于培养的平板计数方法或免培养的SCIVVS的MPP-A的总细胞计数、活细胞计数和存活率。
为了评估在100% D2O活细胞计数的准确度，我们使用传统方法的基于培养的方法比较了孵育前后的细胞计数结果。植物乳杆菌的活细胞计数孵育前后的结果分别为1.26 ± 0.03 × 1010 CFU/g和1.31 ± 0.05 × 1010 CFU/g（H0：p>0.05），表明3小时的100% D2O孵育不会影响活细胞计数（图S2）。总细胞计数孵育前后的结果分别为1.84 ± 0.17 × 1010 CFU/g和2.18 ± 0.21 × 1010 CFU/g（H0：p>0.05），因此孵育过程同样不会影响总细胞计数（图S3）。虽然100% D2O孵育完全抑制了细胞的增殖，在较低的D2O浓度（≤75%）下发生的细胞增殖可能影响总细胞和活细胞计数结果（图2A）：例如，在3小时的75% D2O孵育前后，活细胞计数分别为1.27 ± 0.10 × 1010 CFU/g和2.81 ± 0.09 × 1010（H1：p<0.05），表明选择75% D2O下孵育后会导致细胞有繁殖影响活细胞计数结果（图S2）。因此，我们选择在100% D2O孵育3小时后的MAL作为SCRS基于活细胞计数的实验条件（MAL≤0，死细胞；MAL>0，活细胞）。
然后，使用MPP-A测试SCIVVS方法的准确性。作为对照，传统方法的结果均由三次平行实验得出（图1A；图S2）（i）采用血球板计数法计算总细胞数（平均为1.84 ± 0.17 × 1010 CFU/g；过程需要1小时的时间），（ii）采用平板计数法计算活细胞数（平均为1.25 ± 0.45 × 1010 CFU/g；过程需要约3天的时间）（图1A；图S3）。
在SCIVVS中，MPP-A在100% D2O MRS培养基中厌氧孵育3小时，然后获得SCRS的MAL值，从而获得总细胞计数和活细胞计数结果。总细胞计数由所有的SCRS（MAL≤0和MAL>0）计算得出，而活细胞计数则由那些MAL>0的SCRS计算得出。总细胞计数和活细胞计数结果分别为1.99 ± 0.28 × 1010 CFU/g和1.35 ± 0.13 × 1010 CFU/g，实验结果表明MPP-A存活率为67.84%（图2B）。显然，SCIVVS总细胞计数和活细胞计数结果与传统方法血球板计数法（H0：p>0.05）和平板计数法（H0：p>0.05）的结果没有明显差异（图2B）。因此，SCIVVS可以以无培养的方式从益生菌产品中进行准确的活细胞计数。
SCIVVS单细胞水平检测益生菌产品中各菌种的活力
考虑CDR在测量同化活动方面的定量性质，我们假设除了检测基于细胞死活计数的生存能力以外，还可以从直接从益生菌产品的SCRS中得出单个细胞的原位“代谢活力”。为了验证这个假设，我们定义了rMAL（相对代谢活性水平），它是特定条件下的MAL与最优条件下的MAL（即在纯培养物的对数生长期中）之间的比值，代表相对活力与峰值活力的比较。对于MPP-A产品，平均MAL和rMAL分别为0.0266 ± 0.0019和0.9331 ± 0.0016（图2B）。因此，在短短的五个小时内，SCIVVS可以通过MAL在单个细胞分辨率下量化原位“代谢活力”，并通过rMAL量化相对代谢活力（图2B）。
快速测量单个细胞代谢活力可以拓展应用于很多场景中。例如，可以评估微囊化对产品活力的影响。例如，两种相同B. infantis菌株的益生菌产品X和Y，其中一种有微囊化，另一种没有微囊化（图3A；表S1）。然而，产品X和产品Y基于培养的传统方法检测活细胞数的结果分别为3.40 ± 0.36×109 CFU/g和2.51 ± 0.06 ×109 CFU/g，表明其生存能力基本相同（表S2）。因此，为了探究微囊化对产品活力的影响，必须进行耗时的加速实验（也称为稳定性测试；在该实验中，两种产品都在高温37°C下孵育10天，模拟细胞应激反应，从而推导出活力），然后再次基于传统的平板计数法确定活细胞数。加速实验后产品X和产品Y的活细胞计数结果分别为3.57 ± 0.25 × 107 CFU/g和2.08 ± 0.14 × 109 CFU/g（表S2），其生存率结果分别为1.05％和82.76％。因此，产品Y的生存能力比产品X更稳定，这表明微囊化对保持产品功效是有效的。显然，这种质量评估过程包括长达10天的加速实验以及实验前后每种基于培养的活细胞计数需要超过3天的时间，非常耗时和低效。
图3. 单细胞水平下基于SCRS的益生菌原位代谢活力测试
A）不同加工技术的工作流程（有或没有微胶囊）。还显示了产品X和产品Y的MAL值（B）和异质性指数（HI；C），这两种产品都用100%D2O MRS培养基孵育3小时。
相比之下，通过快速定量地检测细胞活力，基于SCRS的方法极大地简化了评估过程，仅需5个小时的活力检测能轻易的区分出两种产品（不再需要进行10天的加速实验）。实验结果表明，在加速实验之前，基于SCRS的方法中得出的产品X和产品Y的平均MAL值分别为0.0056（MALProductX = 0.0140-0.0084）和0.0172（MALProductY = 0.0247 - 0.0075）（图3B），实验结果表明产品Y的细胞活力是产品X的两倍以上。同时，通过SCRS检测产品X和Y的活细胞计数结果（在进行任何加速实验之前）分别为3.43 ± 0.18 × 109 CFU/g和2..65 ± 0.18 × 109CFU/g（表S2），与传统方法平板计数法的计数结果一致（H0：p > 0.05）。因此，通过利用SCIVVS测量活力而不仅仅可以检测生存能力，还可以定量代谢活力从而更灵敏地评估微囊化的效果，而无需进行耗时的加速实验。
此外，SCRS可以量化细胞内活力的异质性程度。我们提出了一个称为MAL的异质性指数（MAL-HI）的参数，定义为从益生菌产品中采样的单个细胞的MAL的标准差（SD）。值得注意的是，MAL-HIProductX（为0.012）显著高于MAL-HIProductY（为0.009），表明微囊化制造的B. infantis单个细胞的代谢活力不仅更高，而且更均匀（图3C）。因此，对于具有相同活细胞计数的益生菌产品，SCIVVS可以迅速揭示代谢活力水平和异质性（即同步度）。这种量化益生菌活力的能力可以避免进行耗时的加速实验，高活力的细胞可以更好地耐受高压环境。
SCIVVS可以直接在单细胞水平实现益生菌产品的快速菌种鉴定
在单一或多菌种益生菌产品的质量评估中，快速鉴定细菌菌株是非常重要的。然而，现有的基于培养、质谱或宏基因组的方法可能需要长达数天的检测时间。为了建立一种快速（即几分钟内）和低成本的SCRS鉴定方法，该方法不依赖于培养或测序，首先，建立了一个21个纯培养的益生菌菌株的SCRS参考数据库，以上菌株均为标准法定菌株（包括14个Lactobacillus spp.、6个Bifidobacterium spp.和1个Streptococcus sp. 表S3）。每个纯培养的菌株中采集了100多个细胞的SCRS（图4A）。使用一维光谱作为输入的深度学习模型，CNN（卷积神经网络）架构包括18层（17个一维卷积层和残差连接加上一个全连接层；图4B；方法）。采用大规模卷积而不是全局平均池化层，以保留光谱峰值的确切位置。
图4. 商业益生菌产品的基于SCRS的益生菌菌种鉴定
（A）21个标准法定益生菌菌株的平均SCRS以粗体显示，并覆盖在每个菌株的SCRS的代表性实例上。（B）21个菌株类别的混淆矩阵。条目i，j表示在给定类别i的基本事实的情况下由CNN预测为类别j的测试光谱的百分比；沿对角线的条目表示每个类别的精度。（C）使用总共18层的一维残差网络，将SCRS分类为21个应变类别之一。（D）不同比例的植物乳杆菌299V光谱和非植物乳杆菌的模拟样品的预测相对丰度和真实相对丰度的性能比较。
该神经网络的任务被配置为21类分类，其中CNN输出跨越21个训练类的概率分布，然后取最大值作为预测类别。使用3546个SCRS的训练数据集和1519个SCRS的测试数据集作为输入（表S3）。个别类别的性能分解表明，在21类任务中，基于SCRS的ID的平均准确性为93.02±1.39%（±计算为三个验证拆分的标准差；图4C）。远远高于随机森林（RF）和支持向量机的准确性（SVM；分别为59.16%和70.27%）。CNN模型报告了93.02±1.39%的鉴定准确性，因此SCRS能够可靠地区分14个Lactobacillus spp.、6个Bifidobacterium spp.和1个Streptococcus sp.的纯培养菌株。
接下来，为了测试该CNN模型在菌种鉴定方面的准确性，将L. plantarum 299V和包含相等数量的20个标准法定益生菌菌株的混合物库进行模拟微生物群落的构建（1:99、5:95、10:90、20:80、50:50、80:20、95:5和99:1；称为Mock-1、Mock-5、Mock-10、Mock-20、Mock-50、Mock-80、Mock-95、Mock-99；图4D）。对于每个模拟益生菌样品，使用CNN模型进行10次随机SCRS鉴定实验。在每个实验中，L. plantarum 299V在模拟群落中的比例被准确重构（预测和实际结果之间的差异<3.5%；图4D）。因此，该模型可以准确区分L. plantarum 299V单个细胞和其他益生菌细胞。
此外，我们测试了这个CNN模型是否可以直接从MPP-A产品中鉴定单个益生菌细胞。为了完成这个任务，添加MPP-A的L. plantarum 299V的SCRS优化参考数据库（表S1）。然后对MPP-A产品进行检测，详细步骤如下所述，MPP-A在100% D2O MRS中厌氧孵育3小时，将孵育后的样品等分成三份，其中两个等分分别进行了基于16S-rDNA的扩增子测序和宏基因组测序作为对照实验，两者测序结果表明L. plantarum为MPP-A产品主要成分。另一份经过两次洗涤，进行单个细胞的SCRS鉴定，其中平均92.72%的SCRS被CNN模型预测为L. plantarum。以上三种方法均证明了L. plantarum为MPP-A唯一主要成分的结果（图4；表S4），所以，基于SCRS的CNN模型可以在没有纯培养的情况下直接从实际益生菌产品中准确鉴定L. plantarum单细胞。
基于scRACS-Seq，SCIVVS可直接基于单细胞基因组序列对益生菌产品溯源
由于获得SCRS是无损的，直接从益生菌产品中提取的单个细菌细胞可以通过RACS和单细胞全基因组测序（scRACS-Seq）进行来源追踪（图5A）。为了验证这种方法的准确性，首先选用了复合型益生菌产品CPP-A的其中一种菌株L. rhamnosus进行测试（表S1）。
制备样品A进行基准测试，其样品A中包含L. rhamnosus。通过我们引入的拉曼激活重力驱动单细胞封装（RAGE）芯片，单个细胞分别分选到微小液滴中，裂解并通过多重置换扩增技术（MDA）在单细胞水平下扩增DNA（方法）。然后，A1-A4细胞（全部来自样品A）和O5（不含任何细胞的空液滴；作为阴性对照）进行了16S rDNA基因测序，测序结果证实A1-A4细胞均为L. rhamnosus（图S4A；表S5）。除此之外，还对A1细胞进行了鸟枪测序，将303万组装成完整基因组（完整度为93.53％；污染率为1.84％；表1）。基因组比对确定A1细胞为L. rhamnosus，与16S rRNA测序结果一致。
表1. 通过SCRACS-SEQ方法直接从商业益生菌产品中对单个细菌细胞进行精确的单细胞基因组测序。对于样品B，我们以单细胞单管的方式分选了15个单细胞，其中选择了三个细胞进行全基因组测序，每个细胞代表不同的细菌种类，如表所示。
接下来，我们设计了一个模拟微生物群落（L. paracasei vs L. rhamnosus vs L. plantarum=1:1:1，均来自CPP-A）获得样品B。然后对B1~15细胞（来自样品B）和O16（不含任何细胞的空液滴；作为阴性对照）进行了单细胞分离、裂解和DNA扩增，并进行了测序。16S rRNA基因序列确定B3、B6、B10为L. plantarum，B4、B7、B9为L. paracasei，B1、B8、B11、B13为L. rhamnosus（图S4B；表S5）。对于B1、B3和B4细胞，使用HiSeq平台测得了2.99、3.41和3.21百万对读取，分别组装成了近完整的单细胞组装基因组（SAGs），其完整度分别为97.53％、96.58％和99.40％，污染率分别为1.91％、4.41％和1.25％（表1）。这些高质量的单细胞基因组将B1、B3和B4细胞鉴定为L. rhamnosus、L. plantarum和L. paracasei，与基于单个16S rRNA的ID结果一致（表1）。
图5. 通过scRACS-Seq直接从商业益生菌产品中精准追踪的单细菌细胞来源
（A）与基于培养的传统方法相比，scRACS-Seq工作流程用于商业益生菌产品的溯源。比较了乳酸杆菌纯培养的SCIVVS和大量益生菌产品的基因组测序。对于乳杆菌属的纯培养，分别分选并测序三个细胞（B1、B3、B4）。对于益生菌产品，16个细胞（C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16）被分选和测序。（B）基于CheckM估计的SAG的完整性。（C）基于N50长度的从头组装的连续性。（D）从头组装开采的CDS区域数量。（E）从从头组装中挖掘的tRNA类型的数量。
为了测试精确的单细胞衍生SAG与传统的纯培养衍生基因组之间的质量是否存在差异，还将CPP-A中的L. paracasei、L. plantarum和L. rhamnosus菌株进行分离纯化并扩大培养后进行了鸟枪测序和组装，实验结果表明平均N50为148.28 Kbp，基因组完整度为99.43±0.05％（图5B-E）。特别是，以上三个SAG的质量都与纯培养衍生的组装质量相当（表1；图5B-E）。因此，SCIVVS可以产生高质量的单细胞基因组序列，可在单个细胞水平下精准地追踪益生菌产品的菌株来源。
自动化和一体化SCIVVS流程评估复合型益生菌产品质量
在SCIVVS中，活细胞数量、ID和种属水平的存活率和活力等指标的检测均是来自于SCRS，因此，实现自动化是提高SCIVVS采集SCRS通量的关键。为了实现这一目标，测试了各种智能单细胞分割和定位的方法，并进行比较（图6A）。Canny和Sobel在图像分割方面的准确性均<80%（Canny：ACC=61.3%；Sobel：ACC=75%）。这些方法使用阈值判断和梯度计算进行边缘检测，受图像质量影响很大；此外，确定阈值值很困难，需要根据图像质量进行调整。因此，Canny和Sobel只适用于分割稀疏和清晰的细胞图像，而不适用于密集模糊的细胞图像。全卷积网络（FCN）是一种监督学习分割方法，显示了88.7%的准确性。然而，在池化过程中会失去大量信息，降低分割准确性。扩张卷积网络（DCN）的性能最高（95.8%的准确性），尤其适用于带杂质的图像。在DCN中，图像中的杂质像素被标记为背景，并被赋予低权重以帮助准确分类；此外，细胞粘附大大降低，进一步细化分割结果并提高准确性（图6B）。
因此，自动化SCRS采集过程包括图像对焦、单个细胞分割和定位、SCRS收集和质量评估加筛选。为了评估其性能，我们通过自动化采集和手动方法采集了MPP-A产品（表S1）的SCRS。对于SNR（信噪比），两种方法之间没有显著差异，表明光谱质量相当（图6C）。然而，自动化方法数据采集比手动方法平均快10.9倍，比如，分别比数据集A、B和C快9.5倍、12.6倍和10.6倍（每个数据集进行了三次实验），（图6D）。因此，我们的自动化程序可以取代繁琐的手动SCRS采集过程。
图6. 通过SCIVVS进行益生菌质量评估的自动SCRS采集
（A）不同算法下的分割比较。ACC：准确度；IoU：联邦上的交叉点；FPR：假阳性率；FNR：假阴性率；OER：总体错误率。较高的ACC和IoU表示更准确的分割。相比之下，FPR、FNR和OER中的较小者意味着更好的分割结果。（B）应用Sobel、FCN和DCN算法对植物乳杆菌细胞进行典型分割的结果图。图像中的红色标记表示分割中的错误。基于与手动操作（通过专家用户）的比较，对于包括SNR（C）和吞吐量（D）在内的两个性能参数，自动采集的优势是显而易见的。
接下来，以复合型益生菌产品CPP-A（表S1）为例，验证商业益生菌产品的自动化的SCIVVS工作流程。
步骤1. CPP-A的总活细胞计数
为了确定最佳孵育时间，将CPP-A溶解于100% D2O MRS中孵育不同时后进行检测。和之前的孵育实验结果一致，在3小时后，活细胞的比例达到了96.33±0.009%，随着孵育时间增加，活细胞的比例没有再增加（图S5）。因此，对于CPP-A，3小时100% D2O 孵育后的MAL为默认值进行活细胞计数。因此，总细胞数和总活细胞数分别为4.13±0.03×1011 CFU/g和3.84±0.02×1011 CFU/g。此外，92.98%的是活细胞，其余（7.02%）是死细胞。SCIVVS的结果与血细胞计数（总细胞数为4.09±0.07×1011 CFU/g；H0：p>0.05）和平板计数结果一致（3.72±0.35×1011 CFU/g；H0：p>0.05；根据混合到CPP‐A之前的五种纯培养物的结果；图7A）。
步骤2. 菌株鉴定
首先，建立复合型益生菌产品CPP-A中的五种菌株参考SCRS数据库，包括L. plantarum、L. paracasei、B. coagulans、B. animalis和L. rhamnosus，其中每个纯培养物的细胞在100% D2O中孵育3小时，并通过532 nm激光获取SCRS（图7B）。ID任务被配置为5类，其中CNN输出在五个训练类的概率分布，并取最大值作为预测类。训练数据集包含1602个SCRS，测试数据集包含401个SCRS（表S6）。针对各个类别的性能分解表明，在五类任务中，基于SCRS的ID的平均准确率为94.93±0.01%（±被计算为三个验证分割的标准偏差；图7C）。因此，该模型ID准确率为94.93±0.01%，表明可以准确地区分CPP-A中的五种菌株。
图7. SCIVVS应用于复合益生菌产品质量评估的一体化工作流程
（A）基于平板计数或SCIVVS评估的CPP-A的总细胞计数、活细胞计数和存活率。（B）来自CPP-A的5种纯益生菌菌株（植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结乳杆菌、动物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌）的平均拉曼光谱以粗体显示，并覆盖在每个菌株的SCRS的代表性实例上。（C）5个菌株类别的混淆矩阵。（D）在CPP-A中活菌株的预测比例。（E）CPP-A中的每个活菌株的代谢活性水平（MAL）。（F）CPP‐A的异质性指数（HI）和CPP‐A中各活菌的异质性指数。（G）CPP-A的相对代谢活性水平（rMAL）和CPP-A中每个活菌株的相对代谢活性水平。从实际的益生菌产品中，通过SCIVVS方法对16个单细胞（C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16）进行了分类和测序。（H）核心基因组SNPs数量与SAGs完整性之间的关系。显示了使用C2细胞（具有最高覆盖率的副干酪乳杆菌细胞；I）或C10细胞（具有最低覆盖度的副干酪乳酸杆菌细胞；J）的SNPs重建的系统发育树。基于串联SNP位点的Jukes-Cantor距离，使用FastTree构建最大似然树。引导置信度值（以百分比表示）显示在每个分支的上方。比例尺表示0.02或0.002的Jukes-Cantor距离。来自真正益生菌产品的单细胞由黑圈表示；基于批量培养的测序结果用黑色三角形表示。高覆盖率和低覆盖率SAG都与参考基因组聚集在同一系统发育分支中。
为了测试直接从产品中进行ID的可行性，将CPP-A在100%D2O中孵育3小时，直接从从CPP-A中提取的细胞混合物中获取了约400个SCRS。使用上述CNN模型，预测的CPP-A中五个菌株的活细胞比例分别为26.79±0.01%、54.22±0.03%、2.28±0.01%、15.66±0.01%和1.05±0.01%（图7D；表S7）。五个纯培养物的混合到CPP-A中之前平板计数法的活细胞计数结果，L. plantarum、L. paracasei、B. coagulans、B. animalis和L. rhamnosus的活细胞比例分别为26.24%、54.10%、2.02%、17.08%和0.56%。在三个平行实验中，χ2分别为0.9827、9.9214和2.3264，说明尽管不同菌株之间的相对比例波动范围较大（约100倍），但预测比例与实际比例一致性较高（χ2≤11.070，认为两者一致的）。因此，基于SCRS的ID可以准确地鉴定CPP-A中的五个菌株。
步骤3. 在物种水平解析活细胞计数、原位活力和活力异质性指标
基于每个益生菌细胞的SCRS进行ID，可以得到CPP-A中的每个菌株的活细胞计数和原位活力。具体来说，五种菌株的活细胞计数分别为1.03±0.04×1011 CFU/g、2.08±0.10×1011 CFU/g、8.76±0.03×109 CFU/g、6.01±0.05×1010 CFU/g和4.03±0.02×109 CFU/g（表S7）。
此外，基于MAL、HI和rMAL概念，可以揭示CPP-A的代谢活力（绝对和相对）和活力异质性，包括产品整体和CPP-A中每个活菌株（图7E-G）：MALCPP-A = 0.02，rMALCPP-A = 0.53，HICPP-A = 0.01。另外，SCIVVS测得的活细胞率与传统方法的结果一致（表S7）。因此，SCIVVS可在菌株和单细胞水平直接从复合益生菌产品中精准量化以上指标。
步骤4. 溯源
对于这项任务，从CPP-A提取的细胞被单独分选到微小的液滴中，在水生相中进行裂解和扩增，以进行全基因组测序，这是通过单细胞RAGE-Seq实现的，该整个分选过程在水生相中进行，以保护细胞的活力和基因组完整性。具体而言，从CPP-A中分别选取C1~C16个细胞和O11（不含细胞的空液滴作为阴性对照），然后以一细胞一管的方式进行裂解和扩增（表1；方法）。单细胞16S rRNA基因测序揭示CPP-A中的C3、C6、C7、C9、C11、C13、C15为L. plantarum，C1、C2、C4、C5、C8、C10、C12、C14、C16为L. paracasei，它们都是CPP-A的主要成分（表S5）。相应的一细胞全基因组测序揭示了一细胞SAGs的高质量（图5B-E）：（i）平均完整性为81.79%，即与从小鼠粪便中用凝胶珠单独分离的单一益生菌细胞（“SAG-gel”平台）无显著差异（Wilcoxon检验；p > 0.05）；（ii）基于contig N50，两个平台的SAGs的连续性相似（Wilcoxon检验；p > 0.05）；（iii）来自SCIVVS的SAGs恢复了比SAG-gel平台的SAGs更多的编码蛋白基因（平均2561个对1958个；Wilcoxon检验，p < 0.05）；（iv）从两个平台恢复的tRNA基因类型相似（Wilcoxon检验，p > 0.05）。因此，SCIVVS不仅获得了每个细胞的代谢表型，还产生了与SAG-gel平台相当的质量的SAGs。
由SCIVVS导出的一细胞SAGs使得乳酸杆菌菌株之间产生了高分辨率的基因组比较（表1）。为了测试基于SAGs的SNP谱系追踪的可能性，构建了一个包括从CPP-A中纯培养衍生的L. paracasei基因组和从NCBI RefSeq数据库检索的283个L. paracasei基因组的基因组数据库（“LpaDB”）（方法）。在LpaDB中，约78%的基因组共享完全相同的16S序列，表明16S-rDNA基因组学在这种情况下的分辨率不足以进行源追踪。为了测试是否可以获得足够的单核苷酸多态性（SNP）来区分菌株，使用Parsnp分别为SCIVVS导出的SAGs分析了核心基因组SNP。核心基因组SNP的数量与SAGs的完整性呈正相关关系（图7H）。对于覆盖率为99.07%的高覆盖率SAG C2，获得了27,961个核心基因组SNP；使用这些SNP重建的系统发育树显示，直接从CPP-A分选的L. paracasei SAG C2与纯培养中衍生的L. paracasei基因组正确聚类（图7I），表明它们具有相同的起源。值得注意的是，对于覆盖率最低的SAG C10（覆盖率为46.28%），C10的L. paracasei基因组也被准确地放置在系统发育树上（图7J）。对于L. plantarum的SAGs，在一细胞基因组覆盖率为68.68%至90.72%的情况下，也获得了准确的源追踪结果（表1；图S6）。因此，通过从益生菌产品的细胞提取物中直接进行单细胞RAGE-Seq导出的一细胞SAGs，无论菌株的可培养性如何，都足以支持敏感和可靠的源追踪。
基于我们对实验持续时间和消耗品成本的估计，SCIVVS需要约5小时和4.39美元进行全面的质量评估过程，包括活细胞计数、ID、原位活力评估（表S8），并需要额外的约10小时和1.12美元用于DNA制备以进行溯源（单细胞分选、裂解和MDA反应）。相比之下，传统方法需要9~11天并且需要高达 $33.31~$58.61的成本进行活细胞计数、ID和活力检测（通过细胞计数仪），并需要额外的约5天和3.90美元进行DNA制备以进行溯源（平板培养、菌落挑选、液体培养，然后从批量培养中提取DNA）。因此，SCIVVS的速度可以达到传统方法的20倍以上，而成本则降低了一个数量级（表2）。
表2. 传统方法和SCIVVS方法对益生菌产品质量评价参数的比较
1三个步骤的成本或持续时间，包括稀释、菌落采集和液体培养以及DNA提取。2两个步骤的成本或持续时间，包括直接从样品中进行单细胞分选，然后进行细胞裂解和MDA反应。由于基因组测序的成本或持续时间取决于所选择的特定测序平台，因此源追踪的估计不包括测序步骤。
讨 论
像SCIVVS这样综合快速活菌计数、鉴定、原位活力测试和单细胞水平的基因组溯源的综合方法可以解决益生菌产品质量检验中的挑战。SCIVVS利用直接从产品中获取D2O探测的SCRS，而不是基于培养的平板计数菌落：指纹区域基于常见益生菌菌种的参考SCRS数据库高精度地对细胞进行物种级鉴定，而根据C-D峰通过得出绝对和相对MAL可准确量化总活细胞计数和代谢活力。此外，为了追踪目标菌株的来源，可以进一步进行单细胞基因组组装的scRACS-Seq，该技术可基于单细胞的基因组组装，对于多种乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌等菌株高达> 99%的基因组覆盖率。此外，我们还展示了具有自动化SCRS获取的集成SCIVVS工作流程，并通过实际的单菌株和多菌株益生菌产品验证了该工作流程。
SCIVVS采用了拉曼显微光谱、单细胞分选、裂解和DNA扩增的RAGE芯片的集成设计，将基于SCRS的非侵入性代谢表型组学与下游单细胞基因组测序直接耦合，实现了代谢表型导向的单细胞测序。该设计充分利用了快速鉴定、活力、生存能力测试中的快速和通量以及溯源中的高分辨率。相比于基于基因组的应用，这种基于代谢表型的单细胞测序方法在处理大批量样本时具有更大的优势，因为快速和通量是处理大样本量时必须考虑的因素，而基于基因组的应用只针对特定的样本进行。
尽管SCIVVS具有强大的优势，但需要进一步发展以测试和扩展其全部潜力。例如，本研究仅包括21种益生菌的标准法定菌株（全部来自产乳酸菌的物种）作为参考拉曼组数据库用于鉴定，而该方法是否可以扩展应用到到其他益生菌，如芽孢菌、丙酸菌和酵母菌等，还不清楚。此外，由于SCRS对细胞的分类和生理状态均敏感，当益生菌产品中的物种或菌株数量进一步增加时，SCRS是否可以准确地鉴定，尽管我们之前对超过两组的微藻物种的研究结果表面利用SCRS可以区分细胞种类和状态。因此，参考SCRS数据库应扩大范围包括更多的物种和更多的生理状态，以便充分测试基于SCRS的物种识别的范围和分辨率。此外，通过采用拉曼流式细胞术，如FlowRACS，可以进一步提高SCRS获取的速度。在分选步骤中，新的RAGE芯片设计可提高细胞捕获的精度，例如光学钳子辅助池筛或使用人工智能自动分选细胞，也可以增加SCIVVS的通量。此外，需要采用单细胞基因组测序技术，以实现更高质量，更具成本效益的大量分选细胞的测序。
在单细胞水平进行质量评估具有深刻的意义。例如，由于原始样品中的一个细胞对应于琼脂板上的一个菌落（~109个细胞），SCIVVS中的单细胞表型组-基因组分析可以直接跳过耗时的细胞分离和纯培养步骤，而不会牺牲任何分辨率（至少在理论上）；相反，该方法能够提供更准确的基因型和表型的多样性和结构图像，因为基于琼脂板的分离和培养步骤往往会因物种生长速率的变化而扭曲或误代表原始样品。特别是，由于SCIVVS可以检测所有的细胞，包括活跃和休眠（即不活跃但仍然存活）细胞，而传统的琼脂板计数方法只会偏向那些活跃或快速生长的细胞，理论上SCIVVS可以计数更多的细胞。这可能非常重要，特别是对于从食品产品（或其他类型的样品）中准确检测和计数病原菌，目前监管机构的质量标准通常基于平板计数结果。因此，这种一站式进行单细胞代谢表型组学和基因组学分析的技术将为益生菌产品质量评估带来新的标准。考虑到来自美国、中国、意大利、保加利亚等各个地区的商业益生菌产品已经得到评估，但由于国家之间的差异和缺乏从菌株鉴定到表型分析的准确方法，监管标准尚未广泛制定。实际上，欧洲正在呼吁将质量概念修订为更全面的方法，并引入工具来评估高质量益生菌制剂的价值。因此，基于SCIVVS的单细胞代谢表型组学和基因组学将成为一种有利的质量评估方法，以及一种普遍适用的质量评估数据库，支持益生菌和其他活细胞产品的质量控制、过程监控和知识产权保护的新一代标准。
结 论
SCIVVS方法是一种全面有效的益生菌产品质量检测解决方案，提供快速活菌计数、ID、原位活力检测和基于基因组的溯源，最终完成单细菌细胞水平的评估。它充分利用了拉曼显微光谱法在活菌计数、ID和原位活力测试中的快速和高通量，以及源追踪中靶向单细胞基因组测序的高分辨率，因此适合在工业生产环境中处理所需的大样本量。由于SCIVVS速度快20倍以上，价格便宜10倍以上，具有活力和异质性揭示、易于自动化的特点，它是一种新的技术和数据框架，适用于活细胞产品的质量评估，无论是益生菌、人类、动物、高等植物还是藻类细胞制剂。
材料与方法
益生菌菌株和产品在本研究中测试了21种益生菌标准菌株（表S3）。它们被列入欧洲食品药品监督管理局2007年批准的《微生物安全性合格推定》。根据中国卫生部2010年批准的《可用于食品的微生物培养物名录》，这些物种在中国也可用于食品。所有菌株均购自中国工业培养物保藏中心（CN），但DSM 20555、DSM 20072和DSM 9843均购自德国微生物保藏中心（DE），BNCC 341709均购自北纳生物（CN）。MRS和BS培养液均来自海博生物技术公司（CN）。生理盐水和Tween 20来自生工生物工程有限公司（CN）。用于细胞氘标记的D2O来自Sigma-Aldrich Co（美国）。用D2O溶解的MRS培养基通过0.22μm PES膜过滤器（US）过滤。
来自仁和集团（CN）的MPP-A是单一菌株（植物乳杆菌299V）产品（目录号：6973601560317），购自京东（CN）。CPP-A是五种益生菌菌株（植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌、长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌）的混合物，由青岛东海制药有限公司提供（CN）。
基于SCIVVS的益生菌产品质量控制过程
如前所述，所有SCRS均在RACS-Seq仪器（单细胞中心）上获得。对于单细胞快速ID，首先构建了参考SCRS数据库，并使用卷积神经网络基于该数据库对单个细胞进行分类。代谢活力和活细胞计数是基于 SCRS的C-D峰（2040 cm-1-2300 cm-1），通过代谢活性水平（MAL）和相对代谢活动水平检测（rMAL）。单细胞源追踪是通过RACS-Seq仪器以单细胞单管方式对RACS分选的益生菌细胞进行多次置换扩增和测序来实现的。补充方法中提供了方法的全部细节。
数据可用性声明
将本研究中报告的序列数据存入NCBI SRA数据库（BioProject ID:PRJNA917206；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA917206)。支持信息（图表、脚本、图形摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本和更新材料）可在在线DOI或iMeta Science中找到http://www.imeta.science/.
引文格式：
Jia Zhang#, Lihui Ren#, Lei Zhang#, Yanhai Gong#, Teng Xu, Xiaohang Wang, Cheng Guo, Lei Zhai, Xuejian Yu, Ying Li, Pengfei Zhu, Rongze Chen, Xiaoyan Jing, Gongchao Jing, Shiqi Zhou, Mingyue Xu, Chen Wang, Changkai Niu, Yuanyuan Ge, Bo Ma, Gaishuang Shang, Yunlong Cui*, Su Yao*, Jian Xu*. Single-cell rapid identification, in situ viability and vitality profiling, and genome-based source tracking for probiotics products. iMeta, 2023.. https://doi.org/10.1002/imt2.117
作者简介
张佳（第一作者）
● 中国科学院青岛生物能源与过程研究所副研究员、单细胞中心工具酶团队负责人。
● 已发表SCI论文10余篇，申请专利30余项，主持军委科技委项目、国家青年科学基金、省项目、横向项目等7项，累计经费628万元。获“清源学者”人才计划（2023）等支持。主要从事基因合成、酶工程、代谢工程、益生菌的研究等方向。
任立辉（第一作者）
● 中国科学院青岛生物能源与过程研究所高级工程师、单细胞中心仪器工程软件组负责人。
● 主持国家重点研发计划课题、军委科技委仪器研制项目、国家重大科学仪器研制课题和国家青年科学基金等，累计经费1000余万元。获“清源学者”人才计划（2023）等支持。主要研究重点是借助于拉曼技术，进行单细胞检测仪器软件系统开发和拉曼组技术研究工作。
张磊（第一作者）
● 博士后，山东联通工业互联网首席专家，中国人工智能学会会员，全国创新创业优秀博士后。
● 主要研究方向为数据智能和工业互联网，作为主要参与人参与了国家重点研发计划等多个国家/省/市级科研课题，负责多项企业横向合作项目，在相关领域产出多项学术成果。荣获第一届全国博士后创新创业大赛创新赛铜奖，2021中国·山东(青岛)博士后创新创业成果大赛创业组铜奖。
公衍海（第一作者）
● 中国科学院青岛生物能源与过程研究所助理研究员、高级系统架构设计师。
● 主要从事单细胞基因组学、生物信息学与系统生物学等研究方向。已发表SCI论文10余篇，研发了微拟球藻设计与合成数据库系统、单细胞基因组与拉曼组数据分析系统等生物信息学工具，获得软件著作权6项。
徐健（通讯作者）
● 中国科学院青岛生物能源与过程研究所研究员、单细胞中心主任。
● 论文发表于Science、Cell Host Microbe 等170余篇，被引超15000次，H-index 60。获国家高端人才计划（2012；2019）、国家杰出青年基金（2014）、中国青年科技奖（2015）、科技部创新人才推进计划（2015）、中源协和生命医学创新突破奖（2016）、泰山学者等支持。在单细胞分析技术与仪器方面，单细胞中心团队提出了拉曼组（ramanome）、基于代谢活性的最小抑菌浓度（MIC-MA）等概念，研制和产业化了单细胞拉曼科学仪器系列（CAST-R、FlowRACS、RACS-Seq、EasySort等），开发了菌群大数据搜索引擎（MSE）等，服务于微生物组、精准用药、合成生物学、生物安全等广阔领域。
姚粟（通讯作者）
● 中国食品发酵工业研究院副院长、中国微生物学会工业微生物专业委员会主任委员、山东省泰山产业领军人才、新疆自治区高层次引进人才、国际乳品联合会(IDF)中国国家委员会副主席、国际乳品联合会(IDF)微生物分析方法委员会主席。
● 长期从事食品微生物资源挖掘、菌种精准鉴定和精确定量、功能菌种选育评价和发酵机制解析研究，提出中国传统发酵食品用微生物菌种名单，并首次推荐16种中国传统发酵食品用菌种进入IDF国际菌种名单，推进我国传统发酵食品的国际化进程。构建传统发酵食品用微生物资源库，实现我国传统传统发酵食品用菌种资源的安全储存、高效利用和社会共享。带领研发团队开展微生物技术服务和技术转化，服务食品、药品、化妆品、饲料、家电、水质环境等行业领域，制修订国内外标准指南10余项，授权国家发明专利15件，发表科技论文130余篇，通过科技成果鉴定17项，获得省部级和行业协会科技奖励20项。
崔云龙（通讯作者）
● 国家医用微生态工程研究中心主任、中国微生态专疗委员会副主委、国家“万人计划”——“科技部创新创业领军人才”、山东预防医学会微生态分会主任委员、山东省临床微生物肿瘤研究专家组副组长、世界华人消化杂志微生态专委会主任委员、青岛东海药业有限公司董事长。
● 曾获“全国科技系统抗击新冠肺炎疫情先进个人”荣誉称号。主持完成了一类药3个、二类药2个、三类药1个和四类药3个共9个新药的创研工作（其中生物药7个），均已获得新药证书，实现了产业化。先后主持完成了微生态领域的5个863计划项目、2个创新基金项目，1个国际合作项目和山东省重大专项等。
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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！
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