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抗菌洗涤剂对使用过的毛巾上微生物物种水平及异味控制的影响
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综 述
● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.110
● 2023年6月5日，宝洁新加坡创新中心刘吉泉团队和中国科学院青岛生物能源与过程研究所徐健团队在 iMeta 在线联合发表了题为 “Impact of antibacterial detergent on used-towel microbiomes at species-level and its effect on malodor control” 的文章。
● 本研究针对日常使用的棉质毛巾在洗涤过程中的微生物交叉污染问题，分析了样本中微生物含量、多样性和异味成分，为揭示洗后衣物上残留菌导致的难闻气味的产生机制提供了重要证据，并证明了抗菌洗涤剂在控制洗后衣物上难闻气味产生的关键作用。
● 第一作者：TzeHau Lam （林斯豪）
● 通讯作者：刘吉泉 (liu.j.2@pg.com)、徐健(xujian@qibebt.ac.cn)
● 合作作者：刘玉祥、Fumi Iuchi（井内芙美）、Yolanda Huang（黄海燕）、杜可菁、代娅婕、吴佳、Linda Lim（林舒珊）、Jason Goo（巫建森）、Yoshiki Ishida（石田佳樹）
● 主要单位：宝洁新加坡创新中心、宝洁北京创新中心、宝洁神户创新中心、中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心、山东能源研究院、青岛新能源山东省实验室、中国科学院大学
亮 点
● 研究了抗菌洗涤剂对洗涤过程中微生物交叉污染的影响，以及抗菌洗涤剂对使用过的毛巾后续异味的影响；
● 在洗涤过程中，抗菌洗涤剂通过pH依赖的抗菌活性调节漂洗水和毛巾上的微生物交换，并显著降低了微生物负荷，尤其是产臭菌；
● 在洗后并室内晾干的毛巾中，产臭菌的减少代表着挥发性有机化合物（VOCs）产生的减少和毛巾感官效果的提升。
摘 要
在洗涤过程中，微生物的交换以及微生物重复暴露于脏衣服和纺织品而产生的臭味，一直是消费者关注的问题。虽然抗菌洗涤剂可以减少异味，但其除菌和除臭的效果与机制尚不明确。本研究针对日常使用的棉质毛巾在洗涤过程中的微生物交叉污染问题，收集了三个独立洗涤批次的124个毛巾样本，分析了样本中微生物含量、多样性和异味成分（难闻性挥发性有机物，VOCs），并对样本进行了感官评价。结果显示，在洗后并在室内晾干的毛巾上，主要存在一些已知的产臭微生物；洗涤过程中微生物交换很可能是毛巾间接触和水对毛巾的机械搅拌所导致的。重要的是，与非抗菌洗涤剂的对照组相比，抗菌洗涤剂减轻了毛巾上的微生物交换，并显著降低了多种产臭菌的丰度。感官评估和GC-MS分析发现，洗涤过的毛巾上VOCs显著减少。上述研究结果为揭示洗后衣物上残留菌导致的难闻气味的产生机制提供了重要证据，并证明了抗菌洗涤剂在控制洗后衣物上难闻气味产生的关键作用。
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全文解读
引 言
洗涤过程不仅能祛污，而且在服装、床上用品和毛巾的除菌方面也起着至关重要的作用。洗涤过程中的有效抗菌干预，可以影响洗后纺织品的卫生水平。许多研究证明，洗涤不充分会造成微生物在各种纺织材料中存活和生长，进而洗后纺织品中存活或重新生长的微生物会通过代谢产生令人不悦的气味。据报道，从清洗并干燥的衣物中分离的微生物会产生具有恶臭的挥发性有机化合物（VOCs），包括支链不饱和脂肪酸和有机硫化合物。尽管纺织品上的产臭菌可能源自穿着和使用，但洗涤过程中甚至洗涤后的交叉污染也是这些微生物存活和积累的重要原因。因此，纺织品的管理，包括洗前衣物分类、衣物的清洗和存储，也可能对微生物的交叉污染产生影响。
脏衣物上的微生物及其组成对异味的类型和强度具有重要影响。受到使用、纺织品类型和洗涤过程等因素的动态影响，家庭洗涤衣物的微生物群落是多样且独特的。了解这些因素对洗涤过程中微生物群落的影响，对于控制衣物的异味产生至关重要。研究表明，洗衣机洗涤过程中的微生物交换塑造了纺织品上微生物组的多样性，洗后衣物上的微生物负荷则影响后续异味的产生，凸显了洗涤方案和洗涤剂在衣物除菌中的重要性。事实上，减少洗后衣物上的微生物仍是减少后续异味产生的最直接和广泛使用的方法之一。然而，抗菌洗涤剂对洗涤过程中微生物组变化及其最终对臭味的控制效果尚不明确。值得注意的是，以往对纺织品中微生物多样性的理解仅限于属水平，难以准确定位或区分潜在的有益/有害（即致病或引起恶臭）的微生物。鉴于微生物的种类严重影响纺织品的抗菌效果，在更高的分类学特异性水平上（例如物种水平）了解产臭微生物的类型、组成和丰度，对于基于证据的微生物控制以及与纺织品相关的个人卫生改善至关重要。此外，洗涤剂的抗菌效力评估大多限于实验室规模，其中代表性微生物被人工接种到带有人造污渍的织物样本上以模拟洗涤条件。这些研究尚未阐明洗涤剂对天然污染纺织品中异味的控制效果。
2bRAD-M是一种新颖的简化宏基因组测序技术，可以在物种水平阐明低生物量微生物样本中的微生物组成。为了解决上述挑战，我们利用2bRAD-M技术以天然污染的棉质毛巾为对象，研究了抗菌洗涤剂对微生物多样性和异味生成的影响。我们收集了30个使用过3天的毛巾样本，分别用非抗菌洗涤剂和抗菌洗涤剂洗涤，在洗前、洗后、室内晾干三个时间点以及漂洗水取样检测，涵盖了三个独立的洗涤批次，共取样124次（图1）。此外，我们还测量了毛巾中微生物负荷和恶臭二甲基二硫（DMDS）的丰度。这些努力为我们提供了洗后衣物中细菌导致的异味的形成机制，并强调了正确洗涤对于异味产生和良好个人卫生维护的重要性。
图 1. 实验设计示意图
预消毒的棉质毛巾提供给30个人使用3天。毛巾被随机分为3个洗涤批次（n = 10）。使用过的毛巾分别使用非抗菌或抗菌洗涤剂洗涤。收集漂洗水，浸泡预消毒的棉片（n = 3）2分钟并混合搅拌。从洗前、洗后、室内晾干条件下取样分析，并且留存漂洗水样本。值得注意的是，室内晾干是在常规烘箱中模拟，具体描述见补充材料。这些样本经过微生物组分析、恶臭挥发性有机化合物（VOCs）分析、细菌负荷和感官评估。图中使用的插图来自Flaticon.com。
结 果
洗涤过程中毛巾间的微生物交换导致微生物组的均质化
利用2bRAD-M方法，对不同洗涤条件下洗前、洗后、室温晾干后的日常使用毛巾的微生物群落进行了物种水平的检测（图1；补充资料）。有趣的是，洗前毛巾之间的微生物群落高度不相似（图2A-B），存在较高的β多样性（平均Bray-Curtis = 0.72）。这些结果在不同洗涤批次中保持一致（图S1A-B）。在各种洗涤条件下，细菌是棉质毛巾上检测到的主要微生物（>99%）（表S1A）。值得注意的是，洗前毛巾的微生物组由Acinetobacter sp.（30.9%）、Pseudomonas sp.（18.7%）和Moraxella osloensis（11.6%）等常见微生物组成（表S1B）。人体皮肤相关的微生物，如Cutibacterium acnes（2.1%）、Streptococcus sp.（3.0%）和Staphylococcus sp.（0.9%）等也有较高的丰度，可能来源于日常使用过程中与人体皮肤的接触。
基于Bray-Curtis不相似度的非度量多维标度（NMDS）分析显示，洗后和室内晾干毛巾的微生物群落发生了明显的变化，而且根据洗涤剂的类型有进一步的区分，PPERMANOVA < 0.001（图2A；图S1A）。有趣的是，洗后的毛巾之间的微生物群落非常相似和均匀（图2B），且与其他批次的结果一致（图S1B）。虽然与洗后毛巾相比，室内晾干组的微生物群落发生了变化，但是微生物组结构的均匀性仍然存在。此外，与使用过的毛巾一起清洗的预灭菌棉片，在清洗后显示了与洗后的使用过的毛巾类似的微生物群落，进一步支持了洗涤的均质化效应。有趣的是，洗后、室内晾干毛巾的微生物群落主要由已知产臭菌主导，如Moraxella osloensis（18.1%），Acinetobacter junii（6.1%），Acinetobacter ursingii（5.6%），Pseudomonas fluorescens（4.9%）和Stenotrophomonas rhizophila（4.1%）。总的来说，这些结果表明，洗涤过程中的微生物交换导致了洗后、室内晾干组的毛巾之间的微生物群落一致性。
为了研究漂洗水对毛巾上微生物交换的作用，我们将预灭菌棉片直接浸泡在漂洗水中2分钟，并经过24小时室内晾干。结果显示，浸泡并晾干的棉片与漂洗水的微生物群落具有较高的相似性（平均Bray-Curtis = 0.31）（图2B），并且与室内晾干组的微生物群落存在一定的相似性（平均Bray-Curtis = 0.46）。综合来看，这些结果证实洗涤过程存在微生物交换，并暗示了洗涤过程中可能存在两种微生物交换方式：（i）通过毛巾之间的机械搅动接触，（ii）通过漂洗水转移到毛巾。
图 2. 处理组和条件组的物种水平微生物群落比较（洗涤批次1）
(A) 基于Bray-Curtis不相似度的非度量多维标度（NMDS）图。使用PERMANOVA方法测量每个条件之间差异的显著性。(B) 比较了非抗菌洗涤剂/抗菌洗涤剂处理的洗前、洗后、室内晾干的毛巾和漂洗水的微生物组成。相对丰度<1%的微生物被归为"Others"。图中每个柱表示对应洗涤条件下一个毛巾样本上的微生物组成。(C) 不同洗涤条件下（非抗菌洗涤剂或抗菌洗涤剂）洗前、洗后、室内晾干的毛巾样本上细菌总负荷通过菌落形成实验进行评估，还评估了漂洗水和浸泡在漂洗水中的预消毒棉片的细菌负荷。AB：抗菌洗涤剂，PW：洗后，AI：室内晾干。双侧Wilcoxon符号秩检验：***p < 0.001，*p < 0.1。
抗菌洗涤剂的使用减少了毛巾间的微生物交换
为了探究抗菌洗涤剂对洗涤过程中微生物交换的影响，使用过的毛巾与预消毒棉片用两种商业洗涤剂分别洗涤：（i）无抗菌作用的标准清洁洗涤剂；（ii）抗菌洗涤剂。同时采用16S rRNA的qPCR测量和培养法测量毛巾的微生物负荷。无论是否使用洗涤剂，洗前毛巾的微生物负荷分布相对较宽（标准差为1.31），而洗后毛巾的微生物负荷分布相对较窄（非抗菌洗涤剂清洗的毛巾，标准差为0.42；抗菌洗涤剂清洗的毛巾，标准差为0.58）（图2C；图S2A-B）。有趣的是，洗前微生物负荷较低的毛巾在洗后获得了更多的微生物，而初始微生物负荷较高的毛巾在洗后明显减少。这种抵消导致了毛巾具有类似水平的微生物负荷，洗后毛巾的低微生物负荷标准差和高微生物群落相似性验证了上述事实，可能的原因是洗涤过程中的微生物交换。
菌落形成结果显示，抗菌洗涤剂清洗的毛巾的微生物负荷显著降低了1.45（log10倍数，p = 1.5×10-7）（图2C），qPCR的结果也验证了这一现象（图S2A）。在室内晾干24小时后，无论是使用非抗菌（log10 fold CFU increase = 1.51）还是抗菌（log10 fold CFU increase = 1.41）洗涤剂洗涤，毛巾中的微生物增长相对均衡。此外，抗菌洗涤剂减少了漂洗水中的微生物负荷（log10 fold CFU reduction = 1.47；p = 0.07）。浸泡在抗菌洗涤剂的漂洗水中的预消毒棉片，也含有较少的微生物负荷（log10 fold CFU reduction = 1.63；p = 1.7×10-3），表明了从漂洗水到浸泡毛巾的微生物转移减少（图2C）。
为了研究洗涤剂对微生物群落的影响，我们检查了各处理组的β多样性。抗菌洗涤剂处理组的β多样性（Bray-Curtis = 0.34）显著高于非抗菌洗涤剂组（Bray-Curtis = 0.18；p = 5.8×10-05；图S3A），说明抗菌洗涤剂处理组的微生物群落显示出更大的差异。类似地，抗菌洗涤剂处理组的漂洗水（p = 0.041）和浸泡的预消毒棉片（p = 0.035）也显著高于非抗菌洗涤剂组（图S3A-B）。此外，抗菌洗涤剂处理组显示出更多样化的微生物群落（丰富度指数和Shannon指数所示；图S3C）。这一结果在其余2个洗涤批次得到验证（图S3C）。这些结果表明，抗菌洗涤剂可能通过减少毛巾和漂洗水中的微生物负荷来调节洗涤过程中的微生物交换。这使得毛巾保留了洗前的微生物组成，因此与非抗菌洗涤剂相比，抗菌洗涤剂洗涤的毛巾之间观察到了更大的微生物群落差异。
抗菌洗涤剂减少了产臭菌并显著提升了感官效果
通过在物种水平上阐明使用过的毛巾上的微生物组成，可以提高对产臭微生物的特异性识别能力。研究中，我们检测到在所有批次的洗前毛巾中存在Acinetobacter junii（10.8％），Acinetobacter ursingii（2.7％），Moraxella osloensis（11.5％），Stenotrophomonas maltophilia（2.9％），Pseudomonas fluorescens（2.8％）和Pseudomonas putida（1.0％）等细菌（表S1）。这些细菌已被证实会产生各种恶臭的VOCs，如DMDS、二甲基三硫化物、3-甲基丁酸和4-甲基-3-己烯酸，且脏衣物中曾经检测出这些VOCs。我们能够从洗前毛巾中分离出五种产臭菌（Moraxella osloensis未检出）。五种产臭菌分别培养48小时并测量细菌培养物的空气挥发物，检测到DMDS的产生（范围为10-300 ng/L）（图3A）。这一发现支持了这些细菌在适当条件下可以在毛巾上产生恶臭的VOCs的观点，其中DMDS是异味的重要成分。
此外，为了评估抗菌洗涤剂对毛巾异味的影响，我们检测了产臭菌的丰度。与非抗菌洗涤剂组相比，抗菌洗涤剂组（洗后毛巾、室内晾干毛巾、漂洗水）的6种产臭菌的丰度显著降低（图3B），其他批次也得到同样的结果（图S4A）。抗菌洗涤剂组洗后毛巾的DMDS浓度显著低于非抗菌洗涤剂组（图3C）。此外，还邀请了五名感官评委来评估毛巾气味（5 × 使用过的毛巾、2 × 洗涤过的毛巾、3 × 浸泡在漂洗水中的毛巾）。结果显示，抗菌洗涤剂洗涤并经过室内晾干的毛巾在感官上比非抗菌洗涤剂组受欢迎（图4SB）。综上所述，洗涤过程中减少产臭菌对洗后织物中VOCs的产生具有深远影响，更重要的是，产臭菌的减少明显提升了感官效果。
图 3. 用过的和清洗过的毛巾中检测和分离出的产臭菌种类
(A) 对使用过的毛巾上的微生物进行分离培养，在其培养物的空气中检测到二硫化二甲基（DMDS）。(B) 洗后的毛巾、室内晾干的毛巾、漂洗水、浸泡漂洗水的预消毒棉片中的产臭菌的丰度热图。(C) 分别对非抗菌洗涤剂、抗菌洗涤剂洗涤的织物进行DMDS评估。随机选择使用过的毛巾（n = 10）利用GC-MS进行评估。AB：抗菌，TSB：胰蛋白胨培养基。双侧Wilcoxon符号秩检验：***p < 0.001。
讨 论
在这项研究中，我们分析了洗涤过程中纺织品上微生物的物种级别信息。通过对洗前、洗后、室内晾干毛巾样本上的微生物组分析，我们发现洗涤过程中毛巾之间存在微生物交换现象，这与以前的研究结果一致。在三个独立洗涤批次中，我们发现洗涤过程中的微生物交换导致洗后和室内晾干的棉织物样本具有高度的微生物组同质性，与相应的洗前样本相比微生物群落发生了显著的变化。有趣的是，在洗后的毛巾中，微生物的多样性和组成在这三个批次中呈随机变化的趋势。这种现象可能是洗衣机中毛巾放置的随机性以及洗涤过程中的接触导致的。
通过2bRAD-M技术，我们在“脏毛巾”上检测到六种已知的产臭菌，包括Acinetobacter junii、Acinetobacter ursingii、Moraxella osloensis、Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas fluorescens和Pseudomonas putida。此外，我们从“脏毛巾”中分离出5种产臭菌，并验证它们能够产生恶臭的DMDS。微生物介导的含硫氨基酸（蛋氨酸和半胱氨酸）降解释放甲硫醇，并经过后续快速的自氧化反应生成DMDS或二甲基三硫化物。除了DMDS，在纺织品上还检测到了诸如丁酸、3-甲基丁酸、4-甲基-3-己烯酸和己醛等多种VOCs，这表明整体的恶臭强度和类型可能是由微生物群落对纺织品的集体作用贡献的。同时，值得注意的是，2bRAD-M存在一定的局限性，该技术无法区分微生物的死活。因此，未来我们将从单细胞代谢表型的角度，进一步增强对洗涤过程中纺织品上微生物组成及变化的理解。比如借助拉曼组技术平台，分析微生物细胞的原位代谢活性，如活力、底物利用速率、产物含量、环境应激等；进而通过拉曼激活细胞分选技术在单细胞分辨率上建立原位代谢表型组与基因组之间的联系，或通过基于单细胞拉曼光谱的功能靶向性“先筛后养”策略高效分离培养目标微生物。
洗涤的一个重要方面是通过减少纺织品上产生恶臭的微生物和它们的代谢产物来控制臭味。通常，抗菌效果是通过阴离子表面活性剂对细菌细胞膜的破坏作用实现的。然而，洗涤浓度下的表面活性剂与细菌细胞缺乏静电吸引力，因此其杀菌效果有限。我们研究中使用的抗菌洗涤剂通过包含柠檬酸作为pH调节剂来克服这一问题，柠檬酸能够将细菌细胞表面电荷从负向改变为中性或正向，从而使阴离子表面活性剂与细菌细胞发生相互作用。此外，低pH条件本身也可以进一步增强洗涤剂的抗菌活性，在本实验中，非抗菌洗涤剂和抗菌洗涤剂对应的漂洗水的pH值有所不同，分别为6.16和4.46。
结 论
抗菌洗涤剂通过洗涤过程中pH依赖的抗菌活性影响微生物交换，并显著减少洗涤后的微生物数量，特别是产生臭味的微生物。重要的是，产臭菌的减少可以转化为洗后衣物更好的感官效果。总之，我们的研究通过分析抗菌洗涤剂减少恶臭的VOCs释放和改善整体感官效果的机制，为消费者提供脏毛巾除臭的指导。
方 法
实验设计、执行与采样
为30名日本大阪人提供了预先灭菌的新毛巾（28 cm × 28 cm），经过3天正常使用后回收。这些毛巾预先在121°C下高温高压灭菌15分钟。每个回收的毛巾都被剪成两份（14 cm × 28 cm），分别用非抗菌洗涤剂（聚氧乙烯烷基醚、线性烷基苯磺酸钠、脂肪酸、稳定剂、碱性剂、分散剂、软水剂、增白剂、酶，pH = 8.7）或抗菌洗涤剂（聚氧乙烯烷基醚、线性烷基苯磺酸钠、pH调节剂/柠檬酸、稳定剂、分散剂、碱性剂、增白剂，pH = 2.5）清洗。实验使用1台新的小型商用洗衣机分三个洗涤批次进行。1000 ppm洗涤剂剂量：1克产品/升水；洗涤程序：主洗10分钟，漂洗3分钟 × 2个循环；漂洗水用量：6 L纯化水；温度：25°C。分别在洗前、洗后、室内晾干后采样。每次洗涤之前，洗衣机都会被拆卸并用75％乙醇进行消毒，因此洗衣机的微生物转移很少。
每次洗涤会加入预先消毒的棉片（n = 2，14 cm × 14 cm），清洗后在25°C进行孵育，相对湿度保持在> 90％，模拟室内晾干（图1）。此外，收集每个处理的第一次漂洗水，将预先消毒的棉片（n = 3，14 cm × 14 cm）浸泡2分钟。检查第一次漂洗水和浸泡在其中的毛巾，经48小时孵育后的细菌负荷和微生物组。总共收集了124个样本（表S1），并检查了它们的细菌负荷和微生物组。所有样本在收集后密封存放在Ziploc袋中，存储温度为-80°C，以待下游处理。更多细节信息详见补充材料。
引文格式：
TzeHau Lam, Yuxiang Liu, Fumi Iuchi, Yolanda Huang, Kejing Du, Yajie Dai, Jia Wu, Linda Lim, Jason Goo, Yoshiki Ishida, Jiquan Liu*, Jian Xu*. Impact of antibacterial detergent on used-towel microbiomes at species-level and its effect on malodor control. iMeta, 2023. https://doi.org/10.1002/imt2.110
作者简介
TzeHau Lam（林斯豪）
（第一作者）
● 宝洁新加坡创新中心的科学家，在新加坡国立大学获得了生物信息学博士学位。
● 研究方向为探究微生物组对人类幸福和健康的影响。
刘吉泉（通讯作者）
● 博士，宝洁新加坡创新中心的研发总监和首席科学家。
● 主要从事工业微生物学研究，已发表论文50余篇，申请专利10余项。
徐健（通讯作者）
● 中国科学院青岛生物能源与过程研究所研究员、单细胞中心主任。
● 论文发表于Science、Cell Host Microbe 等170余篇，被引超15000次，H-index 60。获国家高端人才计划（2012；2019）、国家杰出青年基金（2014）、中国青年科技奖（2015）、科技部创新人才推进计划（2015）、中源协和生命医学创新突破奖（2016）、泰山学者等支持。在单细胞分析技术与仪器方面，单细胞中心团队提出了拉曼组（ramanome）、基于代谢活性的最小抑菌浓度（MIC-MA）等概念，研制和产业化了单细胞拉曼科学仪器系列（CAST-R、FlowRACS、RACS-Seq、EasySort等），开发了菌群大数据搜索引擎（MSE）等，服务于微生物组、精准用药、合成生物学、生物安全等广阔领域。
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期刊简介
“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！
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