三氯生对人绒毛膜滋养层细胞HTR8-SVneo功能影响的研究

摘要：目的 探讨三氯生(triclosan,TCS)对人绒毛膜滋养层细胞增殖、凋亡和迁移以及主要细胞因子表达等细胞生理现象的影响。方法 2019年1月至9月于南方医科大学南方医院临床医学实验研究中心体外培养人绒毛膜滋养层细胞系HTR8-SVneo，用不同浓度的TCS(0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)处理。CCK-8实验检测细胞增殖活性；Annexin-V/7-AAD双染色检测细胞凋亡；Transwell实验检测细胞迁移能力；酶联免疫吸附实验(ELISA)检测胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP2)和胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP3)的表达；采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)对E-cadherin和Ncadherin表达水平进行检测。结果 经10-4mol/L TCS处理后，HTR8-SVneo细胞增殖活性下降(0.95±0.04 vs.1.29±0.04,P<0.001)，早期、晚期凋亡细胞比例升高[(21.3±0.6)%、(28.7±0.7)%vs.(1.3±0.2)%、(2.3±0.2)%,P<0.001]，细胞迁移能力下降(17.0±4.4 vs. 90.0±2.1,P<0.001),IGF-1、IGF-2、IGFBP2和IGFBP3[(70.5±15.1)μg/L vs.(146.4±8.6)μg/L、(304.3±34.5)μg/L vs.(488.5±19.6)μg/L、(6.5±1.3)μg/L vs.(11.1±1.2)μg/L、(20.4±0.9)μg/L vs.(34.6±2.5)μg/L,P<0.001]表达水平下降，HTR8-SVneo细胞E-cadherin表达上调50%以上，而N-cadherin表达降低近50%(P<0.001)。结论 TCS可以抑制HTR8-SVneo细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡，并影响IGF-1、IGF-2、IGFBP2和IGFBP3细胞因子的分泌和细胞上皮-间质转化。
　　关键词：三氯生 滋养层细胞 细胞生理现象

环境污染物严重影响人类的生殖健康[1]。三氯生（triclosan,TCS）是日化用品中常用的添加剂，也是常见的环境内分泌干扰物之一[2]。日常生活中接触的TCS可通过皮肤、黏膜接触进入血液，对人体内环境产生影响[3-4]。其化学性质稳定，难于降解，容易在体内富集。TCS可以透过胎盘屏障进入胎儿的血液循环[5]。大鼠暴露在过量TCS环境中可以引起激素分泌异常、代谢失调和甲状腺功能紊乱[6]，进而影响生育率和胎鼠的发育[7]。尽管当前还没有明确的临床研究证明TCS对人类生理活动的影响，但其对自然环境和人类健康的潜在威胁越来越受到关注[8]。
　　胎盘滋养细胞是由胚胎外胚层发育而来，能够直接与子宫内膜细胞接触，在胚胎早期着床、母胎物质交换等方面发挥了重要作用。胎盘滋养细胞的异常是引发不孕、流产、早产的重要原因[9-10]。有研究表明，TCS可以引起人足月胎盘合体滋养细胞凋亡，并上调11β-羟类固醇脱氢酶2(11β-HSD2）的表达，但其对胚胎滋养细胞功能的影响和机制尚不清楚[11]。本研究利用人绒毛膜滋养层细胞HTR8-SVneo，探讨不同浓度TCS对细胞生理现象的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料和试剂
　　胎牛血清（Gibco,Cat.No.10099-141),DMEM-高糖培养基（Hyclone,Cat.No.SH30022.01B），青链霉素（Gibco），磷酸盐缓冲液（PBS），胰酶（GENVIEW,Cat.No.9002-07-7),TCS（上海维塔化学试剂有限公司），Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒（联科生物，AP105-100-kit），兔抗金属蛋白酶9抗体（Rabbit-anti-MMP9）、兔抗磷酸甘油醛脱氢酶抗体（Rabbit-anti-GAPDH）、总RNA提取试剂盒（TIANGEN,DP430）、Oligo dT引物（Takara）、M-MLV反转录酶（Promega）、Green qPCR SuperMix（全式金）购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG二抗（HRP-Goat-anti-Rabbit IgG）购自GeneTex公司，胰岛素样生长因子-1(IGF-1）、胰岛素样生长因子-2(IGF-2）、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP2）和胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP3）酶联免疫吸附检测试剂盒购自eBioscience公司，重组小鼠转化生子因子β（TGF-β）购自BD公司。
　　1.2 细胞培养
　　HTR8-SVneo细胞系购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）。使用DMEM完全培养基放置于37℃CO2培养箱中培养传代。完全培养基配方为：DMEM-高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗（105U/L青霉素、105U/L链霉素），配置好的完全培养基放置于4℃储存，使用前在37℃水浴锅中预热。
　　1.3 CCK8法检测细胞凋亡
　　HTR8-SVneo细胞消化、离心并调整细胞密度为2×108个细胞/L，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL。将细胞分为3组，每组设置3个复孔，具体分组为：C0（对照组，无TCS);C1(10-8mol/L TCS）、C2(10-7mol/L TCS）、C3(10-6mol/L TCS）、C4(10-5mol/L TCS）、C5(10-4mol/L TCS）。培养24h待细胞充分贴壁后，进行相应的加药处理24h后送检。
　　1.4 Transwell小室检测细胞迁移
　　实验分组与CCK-8实验相同，每组设置3个复孔。迁移前12h，给细胞换用无血清培养基进行培养。细胞消化、离心并用含0.2%BSA的无血清培养基调整细胞密度为2×108个细胞/L。取细胞悬液100μL加入制备好的Transwell小室，再于下室中加入700μL含有10%FBS血清和对应浓度的TCS的完全培养基；常规培养48h后，用棉签擦去小室上层的细胞，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色。利用奥林巴斯正置显微镜计算小室下层细胞数：随机取6个视野进行拍照，并统计每个视野中的细胞数。
　　1.5 Annexin V/7-AAD双染法检测细胞凋亡
　　细胞分组与CCK-8实验相同，每组设置3个重复对照。细胞接种于6孔培养板中，待细胞充分贴壁后按实验设置加药处理培养24h。消化细胞并制备单细胞悬液移至流式管，PBS洗涤，1000rpm离心5min；弃去上清，加入200μL Annexin V-APC/7-AAD染色工作液（500μL 1×binding buffer+10μL 7-AAD+5μL Annexin V-APC），重悬细胞；避光孵育15mim，用流式细胞仪进行检测。
　　1.6 酶联免疫吸附实验（ELISA)
　　细胞分组与CCK-8实验相同，每组设置3个重复对照。待细胞贴壁后换成含有20μg/L TGF-β的无血清培养基，并加入指定浓度TCS处理24h后收集上清用于检测。
　　1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应实验（qRT-PCR)
　　细胞分组和处理与ELISA相同。培养至细胞充分贴壁后，加入TGF-β和指定浓度TCS处理24h。收集细胞，使用TIAN-GEN总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，使用oligo dT引物和M-MLV逆转录酶进行逆转录得到cDNA。使用全式金Green qPCR Mix进行qPT-PCR反应，具体操作参照说明书。用ΔΔCt法对基因表达水平进行相对定量。qPT-PCR所用引物见表1，其中GAPDH为内参对照。
　　表1 所用引物序列信息
　　
　　1.8 数据统计与分析
　　采用Graph Pad 7.0软件进行数据分析，数据以平均值±标准差表示，以t检验分析组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 TCS抑制HTR8-SVneo细胞系的增殖活性
　　与对照组相比，低浓度TCS组CCK8检测值变化不显着；当TCS浓度大于10-5mol/L时检测值降低（1.13±0.03 vs.1.29±0.04,P<0.01），而当TCS浓度达到10-4mol/L时，检测值降低更为明显（0.95±0.04 vs.1.29±0.04,P<0.001），细胞增殖活性的抑制作用明显增强（见图1）。
　　
　　图1 TCS抑制HTR8-SVneo细胞增殖活性
　　:P<0.01;:P<0.001（与C0比较）；采用CCK8法进行检测，各组对应OD值：C0(1.29±0.04）、C1(1.27±0.03）、C2(1.26±0.03）、C3(1.22±0.04）、C4(1.13±0.03）、C5(0.95±0.04)
　　2.2 TCS处理诱导HTR8-SVneo细胞凋亡
　　Annexin-V/7-AAD双染法标记的细胞经过流式细胞仪分析，对早期凋亡（Annexin-V+7-AAD-）和晚期凋亡（Annexin-V+7-AAD+）细胞分别统计，结果表明较高浓度TCS（≥10-5mol/L）处理后，HTR8-SVneo细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均明显上升，且当TCS浓度达到10-4mol/L时，其诱导HTR8-SVneo细胞凋亡的比例升高更为明显[（21.3±0.6）%、（28.7±0.7)%vs.(1.3±0.2）%、（2.3±0.2)%,P<0.001]。低浓度（≤10-7mol/L)TCS对细胞凋亡影响不大（见图2）。
　　
　　图2 TCS诱导HTR8-SVneo细胞凋亡
　　a.左下象限为正常细胞，左上象限为坏死细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞；b.:P<0.05;*:P<0.001（与C0比较）；早期、晚期凋亡细胞比例：C0(1.3±0.2）%、（2.3±0.2)%;C1(1.2±0.8）%、（2.3±1.6)%;C2(1.4±0.1）%、（2.4±0.9)%;C3(3.1±0.1）%、（4.6±0.3)%;C4(19.8±1.2）%、（24.6±1.9)%;C5(21.3±0.6）%、（28.7±0.7)%
　　2.3 TCS处理抑制HTR8-SVneo细胞迁移
　　通过对迁移到Transwell下层小室的细胞数量进行统计表明，当TCS浓度超过10-6mol/L时，HTR8-SVneo细胞迁移到下室的细胞数量显着下降，且TCS抑制HTR8-SVneo细胞迁移的能力也呈现剂量依赖效应（见图3）。
　　
　　图3 TCS抑制HTR8-SVneo细胞迁移
　　a.各组迁移至下层小室的细胞（200×）；b.:P<0.01;***:P<0.001（与C0比较）；各组对应迁移细胞数：C0(90.0±2.1）、C1(86.7±1.2）、C2(82.3±2.1）、C3(52.3±1.5）、C4(39.0±1.0）、C5(17.0±4.4)
　　2.4 TCS处理抑制HTR8-SVneo细胞IGF-1、IGF-2、IGFBP2、IGFBP3的表达
　　HTR8-SVneo细胞在TGF-β的刺激下可以表达IGF-1、IGF-2、IGFBP2和IGFBP3等细胞因子。用TGF-β联合不同浓度TCS处理24h后，收集上清检测各细胞因子表达水平，ELISA结果表明，TCS处理抑制了HTR8-SVneo表达IGF-1、IGF-2、IGFBP2和IGFBP3等细胞因子，且随着TCS处理浓度的提高，IGF-1、IGF-2、IGFBP2和IGFBP3的表达显着下降，分别由对照组的（146.4±8.6）μg/L、（488.5±19.6）μg/L、（11.1±1.2）μg/L、（34.6±2.5）μg/L，降至C5组的（70.5±15.1）μg/L、（304.3±34.5）μg/L、（6.5±1.3）μg/L、（20.3±0.9）μg/L,P<0.001。见图4。

图4 TCS处理抑制HTR8-SVneo细胞IGF-1、IGF-2、IGFBP2和IGFBP3的表达
　　:P<0.05;:P<0.01;:P<0.001（与C0比较）；各组对应IGF-1、IGF-2、IGFBP2、IGFBP3水平：C0(146.4±8.6）μg/L、（488.5±19.6）μg/L、（11.1±1.2）μg/L、（34.6±2.5）μg/L;C1(144.2±8.3）μg/L、（502.1±27.6）μg/L、（10.8±0.4）μg/L、（36.7±5.1）μg/L;C2(141.2±9.3）μg/L、（501.3±23.2）μg/L、（11.1±1.8）μg/L、（34.5±2.8）μg/L;C3(111.8±17.5）μg/L、（439.2±14.3）μg/L、（9.2±0.5）μg/L、（30.6±3.4）μg/L;C4(107.7±15.4）μg/L、（425±14.8）μg/L、（9.0±0.7）μg/L、（22.9±2.3）μg/L;C5(70.5±15.1）μg/L、（304.3±34.5）μg/L、（6.5±1.3）μg/L、（20.4±0.9）μg/L
　　2.5 TCS处理抑制HTR8-SVneo细胞上皮-间质转化
　　TGF-β可以诱导HTR8-SVneo细胞上皮-间质转化，通过qRT-PCR技术分析上皮-间质转化过程中标记蛋白E-cadherin和N-cadherin表达水平。结果表明，10-4mol/L的TCS可以使HTR8-SVneo细胞E-cadherin表达上调50%以上，而使N-cadherin表达降低近50%(P<0.001，见图5）。
　　
　　图5 TCS处理抑制HTR8-SVneo细胞上皮-间质转化
　　***:P<0.001（与C0比较）；各组对应E-cadherin、N-cadherin水平：C0(1.01±0.04、1.01±0.09）、C1(0.99±0.08、1.02±0.17）、C2(1.07±0.09、0.93±0.06）、C3(1.07±0.09、0.90±0.02）、C4(1.19±0.06、0.82±0.05）、C5(1.57±0.13、0.56±0.06)
　　3 讨论
　　胚胎滋养细胞的正常生理功能对于介导胚胎成功着床于母体子宫内膜具有十分重要的作用。本研究表明，较高浓度（大于10-6mol/L）的TCS会对体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的增殖、凋亡以及迁移产生影响，并干扰细胞分泌表达IGF-1、IGF-2、IGFBP2和IGFBP3。
　　一方面，滋养细胞增殖与凋亡两者间的平衡是维持细胞正常生理功能的必备条件。当细胞增殖活性受到过度抑制或者凋亡细胞明显增多时，正常细胞数量难以维持，将严重影响其生理功能的发挥。滋养细胞可以分泌胎盘催乳素、IGF、IGFBP等细胞因子。其中IGF-1和IGF-2与内环境中的TGF-β等细胞因子共同作用调控自身的增殖活性和侵袭能力，在妊娠过程中发挥重要的作用[12-14]。在本研究中，一定浓度的TCS处理可以抑制HTR8-SVneo细胞的增殖活性，诱导细胞凋亡，抑制细胞因子表达，提示TCS可对滋养细胞产生细胞毒性，影响细胞的生理功能。
　　另一方面，滋养细胞最重要的一个生理功能——侵袭和迁移，有赖于适度的上皮-间质转化（EMT），这在受精卵着床、胎盘形成和母胎联系的建立中起到重要作用。EMT是静止的上皮型细胞滋养细胞（CTB）分化为具有迁移和侵袭能力的间充质型绒毛外滋养细胞（EVT）的过程。EVT细胞将凭借其迁移和侵袭能力将穿透蜕膜基质直达子宫浅肌层使胎盘稳定附着于子宫壁，并且在子宫螺旋动脉的重塑过程中起重要作用，是胚胎成功着床、建立母胎间联系的重要事件。若EMT过程受阻将导致EVT细胞侵袭力减弱，引起胚胎着床失败、妊娠早期流产、胚胎浅着床等异常情况，而后者与子痫前期、胎儿生长受限等关系密切[15-17]；若EMT过度发展，将导致胎盘粘连、胎盘植入[18]等；而不受调控的EMT是绒毛膜癌的表现之一[19-20]。在本研究中，一定浓度的TCS处理可以抑制HTR8-SVneo细胞N-cadherin表达，而促进E-cadherin表达，表明细胞EMT受到了抑制，提示TCS可能通过影响滋养细胞EMT的过程从而干扰胚胎着床。
　　已有研究表明，孕鼠接受过量的TCS刺激会影响胎盘的发育和胎鼠营养的摄取。而用TCS处理人原代子宫内膜间质细胞，也会导致细胞增殖、迁移能力的下降，影响子宫蜕膜[21]。这些结果都提示TCS暴露会引发潜在的生殖毒性，TCS可能通过影响妊娠早期激素分泌、胎盘发育等一系列事件影响妊娠和胚胎发育的过程，导致不孕、流产等[22-24]。值得注意的是，在人体尿液和血液中，TCS累积浓度为10-9～10-7mol/L，而能够在妊娠过程中直接被胚胎滋养层细胞接触到的TCS浓度通常会更低而且很难检测[25]。本研究发现低浓度TCS对滋养层细胞功能的影响并不显着，而在TCS浓度达到10-6mol/L时才会导致滋养层细胞增殖、迁移和分泌功能显着下降。然而在内环境中积累的TCS对细胞的影响是一种低浓度长时间的作用，本研究中仅尝试使用了不同浓度TCS对体外培养的滋养层细胞进行较短时间（24h）的刺激，因此，并不能完全模拟内环境TCS累计带来的生理毒性作用，但这并不意味着体内低浓度TCS的积累不会对健康产生影响。
　　总体来说，本研究发现了一定浓度的TCS可以影响滋养层细胞的增殖、凋亡、迁移、分泌活性及细胞上皮-间质转化等细胞生理现象，提示在孕早期暴露在TCS环境中可能会引起胎盘功能异常导致流产等妊娠相关疾病，而长时间TCS暴露可能影响人类生殖健康，干扰胚胎着床，影响母胎对话，但具体致病机制还有待深入研究。

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　　全文：http://www.53179.net/a/guonei/481.html