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由来自山东大学齐鲁医学院的 Ying Zhou，JingJing Ye以及ChunYan Ji等多名研究人员在期刊Adv Sci (Weinh)（IF=15.1）上，共同发表了题为“Silencing of IRF8 Mediated by m6A Modification Promotes the Progression of T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia”的文章。在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的FB23-2（M9422）和 Actinomycin D（M4881）两种产品，揭示了IRF8在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中的抑制作用，并阐明FTO通过调控IRF8的m6A甲基化修饰，从而介导T-ALL发病的具体机制，为T-ALL的研究提供了极具潜力的新策略。
T-ALL是一种侵袭性血液恶性肿瘤，并且预后较差。因此探究T-ALL的发生发展机制，寻找新的研究靶点，对攻克T-ALL具有重要的科学价值。
研究人员通过比较T-ALL患病受试者以及健康人之间的差异表达基因（DEGs），发现IRF8在T-ALL患病受试者中受到异常抑制（图1A-B）。然后通过慢病毒转染，在T-ALL细胞系Molt4和Jurkat中过表达IRF8，并进行CCK8和EdU检测等实验，发现上调IRF8能显著抑制T-ALL细胞的生长（图1C）以及侵袭迁移能力（图1D-E）。
图 1 A. 通过qRT-PCR检测新诊断的T-ALL患病受试者和健康供体骨髓中IRF8的表达。B. 通过免疫印迹法检测新诊断的T-ALL患病受试者和健康供体骨髓中IRF8的表达。C. 通过CCK8试验分析IRF8表达的Molt4细胞、Jurkat细胞和NCs的增殖情况。D. 过表达IRF8的Molt4和Jurkat细胞，以及NC细胞在Matrigel基质膜下的结晶紫染色。E. 过表达IRF8的Molt4细胞和NC的侵袭和迁移能力。
接下来，研究人员通过构建Irf8敲除小鼠进行实验（图2A），结果显示，Irf8-/-组小鼠的T-ALL发展具有高侵袭性，并且潜伏期更短，同时表现出明显的肝脾肿大和股骨苍白，说明存在白细胞增多、红细胞减少和多器官浸润等情况（图2B）。此外，基因敲除小鼠骨髓GFP+细胞中Ki67水平升高，表明敲除Irf8能促进白血病细胞的增殖（图2C），提示Irf8的缺失能与驱动基因协同作用，共同加速T-ALL发展。
图 2 A. 建立T-ALL小鼠模型的程序。B. 移植了Irf8-/-和Irf8+/+脾细胞的小鼠在移植后两周时的股骨、脾脏和肝脏图像。C. 移植两周后，Irf8-/-组和Irf8+/+组GFP+门控骨髓细胞的Ki67表达情况。
KEGG对DEGs的分析显示，PI3K/AKT信号通路显著富集（图3A）。随后选择PI3K/AKT信号相关DEGs—PIK3R5（图3B）进行进一步研究。免疫印迹（图3C）和CCK8（图3D）结果显示，在IRF8过表达的Molt4细胞中，PIK3R5表达下调，AKT和mTOR的磷酸化水平降低。表明在T-ALL中，IRF8通过PIK3R5负调控PI3K/AKT通路。
图 3 A. KEGG分析显示，与阴性对照（NC）Molt4细胞相比，RNA-seq检测到IRF8表达的Molt4细胞中PI3K/AKT通路富集。B. 热图显示了IRF8表达的Molt4细胞（E1、F1、G1）和阴性对照（NC）Molt4细胞（E2、F2、G2）中与PI3K/AKT信号相关的DEGs。PIK3R5被确定为DEG。C. Irf8-/-和Irf8+/+ T-ALL小鼠脾脏中IRF8、PIK3R5和p-AKT表达的免疫荧光结果。D. PIK3R5过表达对Molt4-NC和Molt4-IRF8细胞活力的影响。
之后，研究人员使用Jaspar数据库，在PIK3R5的启动子区域发现IRF8的潜在结合位点（图4A）。染色质免疫沉淀（ChIP）显示，IRF8免疫沉淀中的PIK3R5启动子序列显著富集（图4B），表明IRF8可直接识别PIK3R5启动子序列中的结合基序，调控PIK3R5转录。
图 4 A. Jaspar数据库预测的PIK3R5启动子区域中可与IRF8结合的潜在基团。B. Molt4细胞中PIK3R5的ChIP‐qPCR分析和相应的电泳图谱。
随后，研究人员对T-ALL数据集GSE13159进行基因组富集分析（GSEA），结果显示T-ALL患病受试者体内各种m6A调控因子发生显著变化，其中以FTO的变化水平最为明显（图5A）。Pearson相关分析表明，在两个独立的T-ALL群体中，FTO和IRF8的表达存在明显的负相关性（图5B）。
图 5 A. T-ALL患病受试者和健康供体（HDs）骨髓中m6A调节因子的Log2表达值。B. 来自GSE13159的174份T-ALL样本中FTO和IRF8表达水平的相关性，Pearson相关性分析。
接下来，用小发夹RNA（shRNA）慢病毒敲除FTO或使用FB23-2抑制FTO水平进行实验，检测发现，两种方式均会导致IRF8表达水平升高（图6A-B），证明IRF8的表达受到FTO介导的m6A修饰的负调控。
图 6 A. 通过Western印迹检测转染FTO shRNA慢病毒（shFTO-1和shFTO-2）或阴性对照（shNC）的Molt4细胞中FTO和IRF8的水平。B. 转染shFTO-1、shFTO-2或shNC慢病毒的Molt4细胞中IRF8 mRNA水平的qRT-PCR分析。
随后，研究人员使用FB23-2处理Molt4细胞，发现m6A的总体丰度提高（图7A），且IRF8的表达提高2至3倍（图7B）。MeRIP-seq分析显示，FTO失活导致IRF8 3′非翻译区（UTR）的m6A水平明显增加。此外，FTO RIP-seq分析显示，FTO结合峰富集在IRF8 mRNA转录本中，IRF8转录本3′UTR中的轨迹与m6A峰重叠（图7C）。
图 7 A. 用2 µm FB23-2或DMSO（NC）培养48小时的Molt4细胞中mRNA的总体m6A丰度，并用LC-MS/MS描述m6A/A的比率。B. DEGs的火山图；IRF8用黑点标出。蓝点：下调基因；红点：上调基因。C. Integrative Genomics Viewer (IGV)追踪描绘用DMSO载体或FB23-2处理的Molt4细胞中IRF8基因的m6A修饰，以及IRF8基因座中的FTO RIP-seq信号和相应的输入信号。
之后设计引物扩增IRF8 3′UTR中包含预测的潜在结合位点的序列（图8A），并进行RIP-qPCR检测，共筛选出五个可能被FTO直接结合的潜在m6A位点（图8B）。随后，将候选m6A位点从A到T分别替换（MUT1至MUT5，图8C），并构建野生型和五个突变型IRF8 3′UTR报告载体。经研究发现，转染WT报告载体细胞的荧光素酶活性明显高于HEK293T-shNC细胞。并且转染MUT1至MUT5报告载体后，可以恢复荧光素酶活性（图8D）。表明IRF8是FTO的一个关键靶点，FTO通过这些m6A位点负调控IRF8 mRNA的表达。随后，研究人员使用FB23-2和Actinomycin D处理Molt4和Jurkat细胞，发现IRF8转录本的半衰期明显延长（图8E）。表明抑制FTO的去甲基化活性可通过促进RNA稳定性和减少RNA降解来恢复IRF8 mRNA的表达。
图 8 A. IRF8 3′ UTR中潜在的m6A结合位点（位点1-5）示意图。引物组3（IP3）包括两个位点：位点3和位点4。B. FTO RIP-qPCR分析显示FTO与Molt4细胞中IRF8 mRNA转录本结合。C. 克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体的IRF8 mRNA 3′ UTR野生型（WT）以及m6A识别位点从A核苷酸突变为T核苷酸的五个突变序列（MUT1至MUT5）示意图。D. 野生型IRF8 mRNA 3′ UTR（WT）和突变型IRF8 mRNA 3′ UTR（MUT1至MUT5）报告载体转染有或无FTO敲除的HEK293T细胞的相对荧光素酶活性。E. 用5 µm FB23-2或DMSO（NC）预处理Molt4和Jurkat细胞24小时，并在指定时间用5 µg/mL Actinomycin D培养的IRF8 mRNA降解检测，并与0小时的mRNA水平归一化。
最后研究人员使用FB23-2处理Irf8+/+组和Irf8-/-组的T-ALL小鼠模型（图9），并通过进行流式细胞术，点印迹检测以及免疫印迹等分析。结果表明，抑制FTO的m6A去甲基化酶活性，能恢复T-ALL中IRF8的表达，从而通过PI3K/AKT信号转导抑制T-ALL的发生。
图 9 建立Irf8-/-和Irf8+/+ T-ALL小鼠模型及FB23-2给药时间表（FB23-2：2 mg/kg）。
该研究使用了购自AbMole的FB23-2（M9422）和 ActinomycinD（M4881）两种产品，FB23-2是一种新型FTO小分子抑制剂，可直接与FTO结合，选择性地抑制m6A去甲基化酶的活性，在外显子RNA甲基化靶向研究领域具有巨大的潜力和优势。在该实验中，研究人员多次使用FB23-2抑制FTO活性，进而更好的研究FTO与IRF8表达之间的调控机制。Actinomycin D是一种转录抑制剂，在该实验中用于在 mRNA降解分析实验中抑制转录，避免新转录的mRNA影响实验结果。
研究人员使用FB23-2抑制FTO的活性，发现IRF8的表达水平升高，细胞增殖受到FB23-2剂量依赖性抑制（图10A-B），并可以通过敲除IRF8得到有效缓解。进一步研究发现，FB23-2处理和IRF8敲除之间在细胞活力（图10C）和集落形成活性（图10D）方面具有明显的交互作用，说明IRF8的表达受到FTO介导的m6A修饰的负调控。
图 10 A. 用不同浓度的FB23-2或DMSO（NC）处理Molt4细胞48小时的IRF8 mRNA水平。B. 用不同浓度的FB23-2或DMSO（NC）处理的Molt4细胞的增殖情况。C. 用shIRF8-1、shIRF8-2或shNC慢病毒转染的Molt4细胞经FB23-2处理后的活力。D. 转染shIRF8-1、shIRF8-2或shNC慢病毒并经1 µm FB23-2处理的Molt4细胞的集落形成能力。
此外，研究人员通过对Irf8+/+组和Irf8-/-组的T-ALL小鼠进行FB23-2处理（图9）。流式细胞术显示，给药FB23-2能显著降低Irf8+/+组骨髓、血液和脾脏中GFP+细胞的比例，以及Ki67的水平（图11A），并且小鼠的存活时间延长（图11B）。说明FB23-2能有效减轻Irf8+/+T-ALL小鼠的白血病负担并延长其生存期。免疫印迹和免疫荧光分析表明，FB23-2能显著增加Irf8+/+组小鼠骨髓和脾脏白血病细胞中IRF8的表达，并抑制PIK3R5的表达和AKT的磷酸化（图11C-D）。因此，研究人员认为FB23-2抑制FTO的m6A去甲基化酶活性，能成功恢复T-ALL中IRF8的表达，并能通过抑制PI3K/AKT信号转导，从而抑制白血病的发生过程。
图 11 A. 流式细胞仪测定的GFP+门控骨髓细胞的Ki67表达水平。B. 用FB23-2或DMSO（NC）处理的Irf8-/-组和Irf8+/+组小鼠的存活率。C. 免疫印迹分析FB23-2或DMSO（NC）处理的Irf8+/+T-ALL小鼠骨髓中的IRF8、PIK3R5和p-AKT水平。D. 给药FB23-2或DMSO（NC）后Irf8+/+T-ALL小鼠脾脏中IRF8、PIK3R5和p-AKT表达的免疫荧光图片。
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