The Innovation Life：EMSA助力揭示杨树扦插生根中LBD16介导通路的保守性

2023年6月15日，北京林业大学林金星研究组、李晓娟研究组，中国科学院分子植物科学卓越创新中心徐麟研究组联合在The Innovation Life期刊上在线发表了题为“Transcriptome framework of root regeneration reveals the conservation of the LBD16-mediated pathway in poplar cuttings”的文章，揭示了杨树扦插中不定根再生的转录组图谱，并通过EMSA等一系列实验证明了LBD16在促进不定根再生方面的保守作用。

扦插再生不定根是一种非常实用的树木无性繁殖方法。杨树是生长快、生物量大的重要树种，广泛应用了枝条扦插再生不定根技术。为解杨树扦插中不定根再生的机制，作者对84K杨（Populus alba × Populus glandulosa）的茎损伤区域进行了时序RNA测序（RNA-seq），基因集富集分析（GSEA）显示，在不定根再生过程中，光合作用相关基因表达下调，损伤和氧化应激反应相关基因、乙烯激活信号通路和脱落酸激活信号通路相关基因均快速上调，这些信号通路可能参与了损伤后茎的保护作用。与硝酸盐跨膜转运蛋白活性和钾离子跨膜转运蛋白活性相关的基因也迅速上调，内质网与细胞质生长素运输相关基因表达上调，与根、分生组织发育和分生组织维持相关的基因也在扦插损伤部位上调。通过分析不定根器官形成过程中与细胞命运转变有关的关键基因，发现PagWOX11.1a/b和PagLBD16.2a/2b/3a表达上调，qRT-PCR分析证实了PagWOX11.1a/b和PagLBD16.3a/b在茎切割后的表达模式。

进一步研究发现许多拟南芥同源基因，在根顶端分生组织或侧根器官形成中发挥干细胞生态位活性和细胞分化功能。此外，生长素信号通路、生长素运输和生长素生物合成相关基因在根再生过程中均表达上调。这表明，在不同物种的扦插过程中，与根系再生有关的基因网络可能是相似的。

随后作者重点研究了LBD16在杨树不定根再生中的作用，对LBD基因进行系统发育分析，结果显示在杨柳属中存在两个AtLBD16同源基因分支，即LBD16.2分支和LBD16.3分支，均位于IIIA亚类。杂交84K杨基因组包含4个LBD16基因，毛果杨（Populus trichocarpa）基因组包含两个LBD16基因，过表达PtrLBD16.3 (35Spro:PtrLBD16.3)显著增强了84K杨的不定根再生，这表明LBD16蛋白在促进不定根再生过程中可能具有进化保守性。

杨树属植物LBD16.2和LBD16.3基因的启动子区存在许多保守区域，包括生长素反应元件（AuxREs）和WOX结合的顺式作用元件（WOXCEs）。 qRT-PCR分析结果显示，用合成生长素1-萘乙酸（NAA）处理断枝损伤区域，PagLBD16.3a/b表达上调，在84K杨中过表达PagWOX11.1a （35Spro:PagWOX11.1a ）基因，PagLBD16.3a/b也表达上调。染色质免疫沉淀（ChIP）和电泳迁移（EMSA）实验证实了PagWOX11.1a蛋白可能与PagLBD16.3a启动子区的一个WOXCE结合。这些结果表明，在杨树再生不定根过程中，生长素和WOX11可能上调LBD16的表达，这与拟南芥中WOX11-LBD16的分子途径类似。

EMSA实验中探针序列为：5'-CATATTTGCATAAACCCATTAATAAATGTTCCCTGAA-3'，分别设置了不同浓度的冷探针与生物素标记的探针进行竞争，冷探针量越多，结合条带越浅，这说明蛋白和探针有结合作用。

综上所述，本研究以及其他杨树WOX11和拟南芥的研究结果表明，生长素、WOX11和LBD16促进扦插不定根再生的调控网络可能具有进化保守性。因此，LBD16有望作为提升不同物种扦插生根效率的分子工具。

原文链接： Transcriptome framework of root regeneration reveals the conservation of the