荧光定量PCR检测法的原理和应用领域

最新推荐文章于 2025-05-02 20:02:43 发布

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荧光定量PCR（Real-time PCR）原理在于通过荧光信号的实时检测实现对PCR产物的定量分析。探针法中，荧光探针在扩增时被分解，产生荧光信号，每扩增一次DNA链就增加一个荧光分子。与传统PCR相比，荧光定量PCR具有高灵敏度、特异性和自动化程度高等优势。Ct值与起始模板量成线性关系，可用于绝对和相对定量分析。荧光定量PCR在医学研究中广泛应用于病原体检测、基因表达差异分析、SNP检测、甲基化检测等领域。

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一、荧光定量PCR原理

在PCR扩增反应体系中加入荧光基团就是荧光定量PCR（Real-time PCR），通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

传统的PCR进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离，并且只能作定性分析，不能准确定量，易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。

在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。