定量检测是什么_实时荧光定量 PCR、数字 PCR 与传统 PCR 对比

简介

实时荧光定量 PCR、传统 PCR 与数字 PCR 概述

	数字 PCR	实时荧光定量 PCR	传统 PCR
概述	测量阴性平行样的比例以确定绝对拷贝数。	在发生 PCR 扩增时进行测量。	在 PCR 循环结束时测量积聚的 PCR 产物的量。
定量？	是，阴性 RCR 反应的比例适合泊松统计算法。	是，因为在 PCR 的指数（对数）期内采集数据，在此期间 PCR 产物的数量与核酸模板的量成正比。	否，但是比较凝胶上的扩增条带的强度与已知浓度的标准品可为您提供“半定量”结果。
应用	病毒载荷绝对定量核酸标准品绝对定量下一代测序文库绝对定量稀有等位基因检测基因表达绝对定量混合物富集和分离	基因表达定量芯片验证质量控制和检测验证病原体检测SNP 基因分型拷贝数变异microRNA 分析病毒定量siRNA/RNAi 实验	DNA 扩增用于：测序基因分型分子克隆
总结	数字 PCR 的优点：无需依赖参考物或标准品通过增加 PCR 平行样的总数可实现所需的精度高度耐受抑制剂能够分析复杂混合物与传统 qPCR 不同，数字 PCR 对出现的拷贝数呈线性反应，可以检测到较小倍数变化的差异。	实时荧光定量 PCR 的优点：提高检测的动态范围无需 PCR 后处理检测能够覆盖低至 2 倍的变化在 PCR 的指数期内采集数据报告基团荧光信号的增加与生成的扩增子数量成正比裂解探针提供扩增子的永久裂解记录	传统 PCR 的缺点：精确度差灵敏度低动态范围小 < 2 logs分辨率低非自动化仅限基于规格的区别分析结果未表示为数字使用溴化乙锭染色不足以定量PCR 后处理

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  要了解为什么传统 PCR 存在限制，务必要了解 PCR 反应过程中发生了什么。基本 PCR 运行可以分为三个阶段：指数期
  每个循环积聚的产物准确加倍（假定 100% 反应效率）。该反应具有高度特异性和精确度。出现指数式扩增，因为所有试剂均新鲜可用，反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍。线性期（高变异性）
  随着反应继续，一些试剂因扩增而被消耗。反应开始减缓，并且每个循环的 PCR 产物不再加倍。平台期（终点：使用传统方法进行凝胶检测）
  反应停止，不再产生更多产物，并且如果放置时间够长，PCR 产物将开始降解。因为每个样品具有不同的反应动力学，所以每支试管或每个反应将在不同的时间点进入平台期。在平台期可以看到这些差异。在平台期内，传统 PCR 进行测量，又称为终点检测。

图 1：PCR 各阶段。

传统 PCR 在平台期测量时结果存在变异

在图 2 中，三个复制样品在反应开始时具有相同量的 DNA，在反应的平台期具有不同量的 PCR 产物（反应动力学变化所致）。因此，在指数期内进行测量将更加精确，在该阶段复制样品呈指数式扩增。

图 2：到 PCR 的平台期，相同样品将产生不同量的反应产物。

实时荧光定量 PCR 在指数期测量可实现更加准确的定量

实时荧光定量 PCR 集中于指数期，因为它可提供更加精确的数据进行定量。在指数期内，实时荧光定量 PCR 仪器计算两个数值。阈值线是反应的荧光强度超过背景时的检测水平。样品达到此水平的 PCR 循环称为循环阈值 (Ct)。Ct 值用于下游定量或存在/缺失检测。通过比较未知浓度的样品与一系列标准品的 Ct 值，可以精确测定未知反应中的模板 DNA 数量。

图3：样品荧光强度超过背景的 PCR 循环称为循环阈值或 Ct。

数字 PCR 统计个别分子可实现绝对定量

数字 PCR 的工作原理在于将样品分割到许多单独的实时荧光定量 PCR 反应中；这些反应部分包含了目标分子（阳性），而其他不包含（阴性）。PCR 分析后，一部分阴性结果用于生成样品中目标分子精确数量的绝对结果，而无需参考标准品或内源性对照品。

图4： 数字 PCR 使用阳性（黑色）与阴性（白色）PCR 反应的比例来计算目标分子的数量。