2020.11.17【读书笔记】丨测序前送样准备&取样要求

• 制备环节的注意事项
  • 微生物样本取样安全性
    • 注意安全
• 样本准备与保存方法
  • 植物组织
    • DNA含量：叶片＞花、茎、果实＞根、种子
    • 尽量选择新鲜、幼嫩的叶片组织
    • 采集流程
  • 动物组织
    • DNA
      • 新鲜组织，题除结缔组织等非研究所需的组织类型
      • 预冷的PBS冲洗组织残留血液
      • 混合均匀后冷冻保存
      • 干冰运输
      • 注意事项：样品手机过程保证样品断血后半小时内完成样品制备
  • 动物组织-三代测序
    • 推荐送样
      • 肝脏、肾脏等内脏组织、肌肉组织或者全血样品
      • 肠道组织清洗不彻底易有微生物污染
  • 细胞-RNA
    • 细胞要求
      • 一次提取反应所需细胞数需>1 x 10 6个, ≤1 x 10 7个，以3 x 10 6-1 x 10 7 个为宜；
      • 送样量满足3次以上提取，建议分装送样，每管满足一次提取量，即3 管 1 x 107个；
      • TRIzol 裂解液送样，可根据细胞裂解是否充分，适当增加裂解液用量；
      • 细胞富集过程，请勿使用胰酶，操作不当易导致细胞损伤从而导致提取的RNA降解或有胰 酶残留导致提取蛋白污染严重；
    • 贴壁细胞
      • 从培养箱中取出贴壁培养的细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好（正常细胞融合度在80 %左右）
      • 弃去培养基，向细胞培养瓶或培养皿中加入 5 mL PBS（RNase free，室温）， 洗一次
      • 弃尽PBS，加入适量TRIzol Reagent 细胞裂解液，反复吸打多次直至看不见明显的细胞团，形成清亮不粘 稠的细胞裂解液 Ø 将裂解好的细胞转移至2 mL 离心管（RNase free）中，置于-80 ℃或液氮中长期保存；
      • 运送方式：干冰运输
      • 注意：判断裂解液加入量是否合适的标准可以根据细胞溶解物的粘度来判断。在细胞刚溶解时，可以发现 有丝状物出现，若裂解液加入量合适，吹打几次后，丝状物会消失，液体粘稠性下降；若裂解液的量过少， 丝状物往往一直存在，液体粘稠性大，应继续补加裂解液。裂解液加入量过少，会导致抽提的 RNA 降解
    • 悬浮细胞
      • 确定细胞生长状态良好；离心得到细胞沉淀（依据客户实验室细胞离心步骤，注意细胞离心要适度，不要 使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透）；
      • 弃去培养基，加入 1 mL PBS（RNase free，室温），轻轻将细胞沉淀悬起， 转移至 2 mL 离心管 （RNase free）中；
      • 离心（依据客户实验室细胞离心步骤，注意细胞离心要适度，不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分 渗透）得到细胞沉淀，弃去PBS；
      • 加入适量细胞裂解液，反复吸打多次直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于裂解液中
      • 置于-80 ℃或液氮中长期保存
      • 运送方式：干冰运输
  • 细胞-DNA&PB
    • 一次提取反应所需细胞数需>1 x 10 6个, ≤1 x 10 7个，以3 x 10 6-1 x 10 7 个为宜；
    • 可以将细胞经裂解液裂解后冻存运输。
    • 从培养箱中取出贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好 （正常细胞融合度在80 %左右）
    • 弃去培养基，用 PBS 缓冲液快速洗一次，除去 PBS 缓冲液，贴壁细胞可用细胞刮将其刮下
    • 收集的细胞转入 1.5 mL 的 EP 管中用液氮速冻后置于-80 ℃保存
    • 干冰运输
    • 注：由于细胞量少，干冰运输务必保证细胞处于冷冻环境，防止环境温度增加细胞降解；同 时因样本少易降解，务必备注信息单微量样本液氮交接
  • 细胞-ATAC-seq
    • 样本要求
  • 细胞-Hi-c
    • 需要进行甲醛交联固定； 
    • 一般来讲 2*106 个细胞满足一个 Hi-C 文库，建议培养到 1* 107个细胞用于固定，以保证试验的可重复性，由于细 胞的数量可能会影响 Hi-C 试验的质量，因此需要尽量做 到细胞数目精确 
    • 交联细胞 
    • 细胞裂解
  • 全血样本-RNA
    • PAXgene Blood RNA Tube：参照医学采样指导1人全血样本制备流程 
    • TRIzol血液样本制备:取15 mL管1个，加入 6 mL TRIzol和 2 mL 新鲜采集的血液（TRIzol: 血液 = 3:1），用移液器吹打几次以帮助裂解样本中的细胞；震荡混匀1-2 min，直到絮状 物全部溶解；室温孵育5 min以使核蛋白体完全分解；将处理过的混合液分装到2 mL 旋盖尖 底离心管中；封口膜封存，-80 ℃冻存。干冰运输。 
    • 采集新鲜的血液直接提取核酸送样，或直接分离淋巴细胞用TRIzol裂解后送裂解液（会大大 提高成功率）。 
    • 采集时要注意防止溶血、污染
  • 全血样本-DNA&PB&ATAC-seq
    • 用医用抗凝管或已装有抗凝剂（选用柠檬酸钠或 EDTA 抗凝剂，不可用肝素）的旋盖管收集 全血样本 
    • 采集时要注意防止溶血、污染 
    • 上下轻轻颠倒混匀十次后，转移至-20或-80 °C长期保存（实际根据采血管的说明要求操作） 
    • 干冰运输：血液采集管请不要用需专门对应提取试剂盒的采血管，以防送样后我们因无对应 试剂盒影响提取时间（尽量送样前沟通）
  • 酵母
    • 单细胞真菌； 
    • 一次反应所需酵母菌的量需≤1 x 107 个，以 5x 106-1 x 107 个为宜； 
    • 送样量满足3次以上提取，分装送样，每管满足一次提取量，即 3 管 1 x 107 个； 
    • 显微镜下观察酵母菌生长状态，收集对数期生长旺盛的酵母菌； 
    • 将适量体积的酵母菌液转移至将 2 mL 离心管（无菌，无核酸酶）中，室温14000 xg 离心1 min 
    • 弃尽培养基，根据细胞量，将酵母细胞沉淀迅速置于液氮中冷冻0.5~3 h，然后转移至-80 ℃或 液氮中长期保存 
    • 运送方式：干冰运输
  • 真菌
    • 显微镜下观察真菌生长状态，根据菌类的生长规律，收集处于生长旺盛期的菌体。 
    • 进行称重，一次反应所需的真菌量为50 ~100mg（由于不同真菌得率差异较大，所以建议送样 量尽量多或根据客户经验得率送满足3次的量） 
    • 如果组织体积较大，应尽量将组织剪切成长宽高均≤0.5cm 的小块。 
    • 真菌取样方式以客户实验室经验操作即可，要求取样后到速冻前时间短，菌处于快速生长的活 跃期 
    • 取样后的真菌置于预冷的离心管或冻存管中，根据组织量多少，迅速置于液氮中速冻 0.5~3 h， -80 ℃ 长久保存 
    • 运送方式：干冰运输
    • 注意：注意如果提取RNA：请勿直接寄送培养平板，低温保鲜寄送的真菌培养平 板无法保证菌体的生长状态，冷冻平板无法取样
  • 细菌
    • 显微镜下观察细菌生长状态，或者根据生长曲线，收集对数期的细菌； 
    • 将适量体积的菌液转移至2 mL 离心管（无菌，无核酸酶）中，于室温下14000 X g 离心1 min 
    • 弃尽培养基，根据细胞量，将细菌沉淀迅速置于液氮中冷冻0.5~3h，然后转移至-80 ℃或液氮 中长期保存 
    • 运送方式：干冰运输
  • RNA样本
    • 方案一（推荐）：提取完成后的RNA溶液直接放入-80 ℃冰箱中进行保存； 
    • 方案二：采用醋酸钠乙醇沉淀法沉淀RNA，并且将样本直接放入-80 ℃冰箱中进行保存； 
    • 方案三：向沉淀后的RNA固体中直接加入1 mL 75 %的乙醇，并且将样本直接放入-80 ℃冰箱 中进行保存； 
    • 运送方式：干冰运输
  • DNA样本
    • 方案一（推荐）：提取完成后的DNA溶液直接放入-20 ℃冰箱中进行保存；
    • 方案二：采用醋酸钠乙醇沉淀法沉淀DNA，并且将样品直接放入-20 ℃冰箱中进行保存；
    • 方案三：是向沉淀后的DNA固体中直接加入1 mL75 %的无水乙醇，并且将样品直接放入-30 °C冰箱中进行保存；第四种方案是提取完成后的DNA样品使用低温冷冻仪冷冻成干粉（可常 温运输）
    • 运送方式：干冰运输
  • 特殊处理
    • 特殊处理：盐处理、温度处理、药物处理、病毒侵染、伤害处理、干旱处理等；
    • 不同程度的处理对样本的RNA 质量会造成不同程度的影响，常见的会导致RNA 的降解或者得 率降低。
    • 经过特殊处理的样本，在送样时，务必请在样本信息单中进行详细的备注，以便尽量提高提取 的成功率和避免样本的浪费。
• 信息单填写要求及样本寄送
  • *是必填项
  • 要重视注意事项
  • 信息单要分类填写
  • 注意样品名称要求
  • 立项及时
  • 及时云平台上传信息单
• 样本寄送
  • 样本按照合适的条件寄送 ，样本放置在中间层，干冰覆盖； 
  • 样本送样量需要在合理范围内，用合适的离心管盛放，即使做多个不同项目， 也要在取样环节做好分装，减少后期的冻融次数,比如同时想提取DNA或 RNA，那么务必分成两管送样 
  • 核酸：置于1.5ml 或2.0ml离心管内，并用封口膜封好，按信息单样品顺序码盒（禁用PCR板或其他小于1.5ml规格的小管送样） 
  • 组织：冻存样本时，建议选择螺纹离心管，尽量不要用普通离心管，防止爆 管。禁用锡箔纸送样，2020年2月1日起，锡箔纸送样会被拒收
• 送样量参考（略）
• 返样
  • 信息单填写的是否返样，务必要准确 
  • 申请要及时，结项后3个月 
  • 返样单填写时，勾选的选项要正确 
  • 目前返样时按合同号进行处理
• 个人总结
  • 微生物样品取样需要重视安全性
  • 细胞样品都不能用胰酶处理，以免损伤细胞
  • 这个送样PPT可以保存下来，客户需要时使用
  • 真菌、细菌都不用培养平板寄送，要用将菌液转移至离心管
  • 特殊处理送样需要在样本信息单中进行备注