二代和三代测序数据的生殖系变异分析最佳实践综述

最新推荐文章于 2025-06-11 18:07:55 发布

生信与基因组学

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分类专栏： WES-WGS-NIPT-CNVseq 文章标签：数据挖掘数据分析健康医疗

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二代和三代测序数据的生殖系变异分析最佳实践

1. 背景知识

二代测序（SGS） 能够同时并行测序数百万到数十亿条短序列。然而，快速的技术创新已将我们带入了测序的第三个时代，长读长技术使得对非常隐蔽的基因组区域进行测序成为可能。通过 SGS 或三代测序（TGS） 分析生殖系变异是人类遗传学和分子医学的一个关键领域。这些变异会对遗传性疾病的诊断和易感性产生重大影响，并影响对医学治疗的反应。因此，准确识别这些变异对于遗传疾病（尤其是罕见疾病）的早期诊断、预防和管理至关重要。

SGS 和 TGS 彻底改变了在基因组水平上有效检测和表征生殖系变异的能力。SGS 能够并行读取数百万个 DNA 片段，实现高覆盖度和精确的数据生成。此外，TGS（如 PacBio 系统和纳米孔技术）现在提供了实时读取更长 DNA 片段的可能性，能提供有关基因结构和变异的更全面信息。

2. 主要目标

回顾在 SGS 和 TGS 获得的计算数据分析的不同阶段中使用的各种分析工具，重点关注全基因组范围内的小和大生殖系变异的检测，以及那些不常被考虑的变异，如人类白细胞抗原（HLA）基因型、纯合子连续片段（ROH）和线粒体 DNA（mtDNA）改变。

3. 测序平台

有几家公司开发了具有独特优势的不同技术，主要包括Illumina、Element Biosciences、Ultima Genomics、ThermoFisher（Ion Torrent）和 MGI。

Illumina 作为市场领导者，采用合成测序技术，读长较短但准确性高，应用广泛，尤其在临床和研究基因组学领域。像 NovaSeq 这样的平台支持人类、植物和动物的全基因组测序（WGS）。

Element Biosciences 的 Aviti 平台也采用合成测序技术，但侧重于降低测序成本，同时保持与 Illumina 相当的准确性。研究表明，Aviti 能生成比 Illumina 系统更干净的数据，假阳性更少。

Ultima Genomics 是一个较新的颠覆性平台，专注于超低成本测序，旨在将全基因组测序成本降至 100 美元。然而，其新颖方法的具体细节是专有的，尚未得到更广泛的应用。

Ion Torrent 是一个 SGS 平台，使用一种称为半导体测序的独特技术。与其他平台不同，Ion Torrent 直接检测核苷酸掺入过程中释放的氢离子（质子）。这一过程允许进行实时、无标记测序，使得 Ion Torrent 系统比其他一些平台更快、成本更低。

MGI（华大基因的子公司）使用 DNBSEQ 技术，提供基于 DNA 纳米球的测序，以高精度和低成本著称，与 Illumina 相当，但具有独特的特点，如较低的重复率 。一项研究表明，其测序通量、周转时间、单碱基质量、读长质量和变异检测与 Illumina HiSeq2500 数据相似。

4 生殖系变异(Germline variant)分析

4.1 比对和预处理

数据的正确比对和预处理的重要性，特别是在孟德尔疾病的背景下。这些初步阶段对于确保测序数据分析的准确性和意义至关重要。通过比对，测序得到的 DNA 片段能够正确定位到所研究生物体的参考基因组序列上，从而识别相关的遗传变异。另一方面，预处理包括清理和标准化数据，以去除实验偏差，从而提高结果的质量和可靠性。

4.2 质量控制

Illumina 测序在碱基识别阶段将原始荧光信号转换为 “读段”（从测序过程中获得的短核苷酸序列）。读段以标准的 FASTQ 格式（.fq 或.fastq）保存在文本文件中。每个读段由其来源的 DNA 片段的核苷酸序列以及每个核苷酸的质量值（以 Phred 对数尺度表示读取错误的概率）表示。

FASTQ 文件的质量控制（QC）和预处理对于确保下游分析（如变异检测）的可靠性至关重要。通常，QC 包括以下内容：

识别并去除任何测序接头；
识别并去除任何长度超过 10% 的未确定核苷酸（“N”）的读段；
识别并去除任何低质量核苷酸（通常 QPHRED<5 的比例超过 50%）的读段。

QPHRED（Phred 质量）分数是 SGS 中用于估计碱基识别质量的指标。它反映了碱基被错误识别的可能性。该分数使用对数尺度计算，QPHRED 分数为 20 和 30 分别表示碱基识别错误的概率为 1% 和 0.1%。实际上，分数越高，碱基识别的准确性越高。达到 Q40 对需要高精度的应用（如临床诊断、罕见变异检测和大规模群体基因组学）非常有益，在这些应用中，即使是微小的不准确也可能导致数据解释的重大错误。

用于质量控制并同时收集 FASTQ 文件描述性指标的最广泛使用的软件是 FastQC。
对于接头修剪和低质量读段去除，最常用的工具是 Cutadapt 和 Trimmomatic。随着测序样本数量、测序产量和读长的增加，为提高该阶段的效率，fastp 因其快速执行而成为质量控制阶段最广泛使用的程序之一。

4.3 参考基因组

参考组装版本选择不当会影响下游阶段的结果；因此，必须根据研究目的预先考虑其选择。

尽管人类基因组是特征最明确、最了解的基因组，但仍在进行许多努力以获得一个完整的（无间隙）版本，该版本能够代表不同人类群体的遗传多样性。对于人类和其他模式生物，参考组装由基因组参考联盟（GRC） 整理和发布。

目前，人类参考基因组最广泛使用的版本是 hg19（GRCh37，2009 年） 和 hg38（GRCh38，2013 年） 。此外，端粒到端粒联盟（T2T，2022 年 1 月） 和人类泛基因组参考联盟最近发布的新组装值得关注。主要版本的组装报告了标准染色体（人类为 1 - 22、X、Y）、线粒体染色体以及各种未定位和 / 或未确定位置的重叠群的序列。