16S全长测序揭示绿头虻肠道微生物及共生细菌

论文题目：Greenhead (Tabanus nigrovittatus) Wolbachia and Its Microbiome: A Preliminary Study

期刊：Microbiol Spectrum

研究背景

绿头虻（Tabanus nigrovittatus）的雌虫刺吸牲畜的血液，危害家畜，是美国东部地区的主要害虫之一，其分类所在科有140个属，包括4000多个种。由于绿头虻生活史的大部分时间都在地下，所以其种群数量很难控制，而它们的卵和幼虫又是许多沿海鸟类和鱼类的食物来源，这使得消灭策略变得复杂。

沃尔巴克氏体(Wolbachia)是一类广泛分布于节肢动物生殖组织内的共生细菌。自然界中约40%-60%的昆虫物种受其感染。这类细菌能影响宿主生理、微生物群组成和病原体的传播。越来越多的证据表明，它们对宿主不是单纯的寄生，而是有互惠互利的好处，例如在营养压力时期或赋予宿主对病毒感染的抵抗力。研究者于2019年收集美国盐沼附近虫体样本，以评估当地系统发育多样性和共生沃尔巴克氏体的情况,通过PacBio 16S rRNA基因全长测序进一步确定其肠道微生物群落的物种多样性。

主要结果

1.绿头虻的多样性和沃尔巴克氏体的鉴定

根据COI基因结果进行系统发育分析，研究了绿头虻标本之间，及其与其他属种的关系。分析表明，所有10个标本均来源于一个分支，亲缘关系密切。通过巢氏PCR扩增检测低水平的沃尔巴克氏体的5个标记(ftsZ、fbpA、dnaA、coxA和gatB)，系统发育显示了两种感染类型的“超群”，即分支A和B。

2.绿头虻肠道细菌多样性和组成

同时采用Illumina(V4区)和PacBio(全长16S rRNA基因扩增子)测序平台对4个绿头虻标本(BA2、BA3、BO2和BO3)的微生物群进行了检测。变形菌门在微生物群落中所占比例最大（30-70%），但各样本组成不相同；大部分样本也显示了螺旋体的存在，它是变形菌门的一员，也可以感染昆虫。沃尔巴克氏体的存在与微生物群中较高的α变形菌门代表具有相关性，表明沃尔巴克氏体的存在影响了宿主的微生物群落构成。

3.针对绿头虻肠道细菌多样性，比较不同平台测序结果

在下表中研究者对两种测序平台在不同分类水平的注释鉴定结果做了详细比较。可以看出PacBio全长16S rRNA在属水平的鉴定效果是高于单V4区的，其中两种低丰度的螺旋体单（Enterobacter、Yersinia）V4区未鉴定到属。全长16S rRNA极大的减少了Unclassified的占比。两种平台在大多数样本的门水平注释效果较一致，属水平的差异可能是文库制备或测序前使用的不同PCR引物有一定偏好性造成的。

小结

1、本文结合了多种平台测序的结果，共同分析目标共生菌（一代测序）和肠道菌群多样性（二代、三代测序）之间的关系，发现了沃尔巴克氏体会影响宿主α变形菌门的组成。

2、采用16S rRNA全长基因测序结果验证了单V4区测序结果，Pacbio有效提高了鉴定的准确性，减少了Unclassified在注释结果中的比例。

文章链接：《Microbiol Spectrum》
DOI:https://doi.org/10.1128/spectrum.00517-21