QTL-seq 鹰嘴豆

最新推荐文章于 2022-12-18 15:32:43 发布

Amy-cui

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QTL-seq for rapid identification of candidate genes for 100-seed weight and root/total plant dry weight ratio under rainfed conditions in chickpea

用QTL-seq快速鉴定100粒种子重量和根比例，在雨养的条件下的鹰嘴豆内。
*Plant Biotechnology Journal *
http://dx.doi.org/10.1111/pbi.12567
IF:7.443 (2017)

概要
极端干旱是鹰嘴豆生产力的主要制约因素。两个组成部分负责干旱胁迫下的产量下降，包括种子大小和根长度/根密度的减少。因此，QTL-seq方法被用于鉴定在雨养条件下候选基因组100个种子重量（100SDW）和总干燥根重量与总植物干重比率的区域（RTR）。全基因组SNP分析极端表型混池–ICC 4958 、ICC 1882群体，确定了两个重要的基因组区域，一个位于CaLG01上（1.08 Mb），另一个在CaLG04（2.7 Mb）连锁群上在100SDW。同样，对于RTR鉴定到CaLG04（1.10Mb）上的显着基因组区域。综合分析，揭示了四个和五个假定候选基因分布与100SDW和RTR相关。随后，使用CAPS / dCAPS标记验证100SDW的2基因（Ca_04364和Ca_04607）和RTR的一个基因（Ca_04586）验证RTR。确定候选基因组区域及基因可能对鹰嘴豆分子育种的改良有用。

前言：
鹰嘴豆重要谷物庄稼；营养丰富；
With an objective of identifying candidate genomic regions responsible for 100SDW and RTR, the QTL-seq approach was adopted. We were able to precisely localize the genomic regions for the two target traits and identify five genic SNPs in four candidate genes for 100SDW and six genic SNPs in five candidate genes for RTR. The involvement of candidate genes was further validated through co-segregation analysis in the entire RIL population derived from ICC 4958 x ICC 1882.

RIL（Recombinant Inbred Lines）重组自交系:

生物学中用于遗传分析及作图的一类群体,由F2群体的个体多代自交产生,群体中每个株系都是纯合的。

群体构建：

SDW：seed-weight;

RTR：total dry root weight/total plant dry weight

ICC 4958 x ICC 1882 mapping population
two extreme bulks each for 100SDW and RTR(分别测两个high/low极端bulk，每个混池15个个体，一共四个混池),parent ICC 4948 亲本测序6X；
（自我评价：测序量不是特别多；一般情况下，
1.群体构建F2,RIL，DH等群体好于F1;
2.混池个体为20个，测序量要达到至少覆盖一层，即测序20x;
3.亲本测序至少10x;重测序技术优于RAD,GBS策略；）
RIL ：SDW表型范围在12.24g-30.80g; 15个体-high 100 SDW (25.27g-30.8g)、low 100 SDW(12.24g-13.59g)，构建混池测序。其中亲本对应表型为：ICC4958:30.65 $\pm$ 2.65g、ICC1882:14.03 $\pm$ 3.21g；
RIL：RTR表型范围23.40%-39.95%；15个体-high RTR(33.18%-39.95%)、low RTR(23.4%-25.84%)，构建混池测序。其中，ICC4958:31.83 $\pm$ 0.02%、ICC1882:26.38 $\pm$ 1.88%；

result

–100SDW找到两个候选区域，其中1.08M(3.07–4.15 Mb)的region没有SNPs，作者猜测The lower number of SNPs may be due to the narrow candidate region and/or low coverage. 另一个区域2.7M(11.12-13.82)有21个SNP，其中5个SNPs in 未验证（putative）的基因，4 in intron;1 in exon, 非同义突变基因，且在ICC4958中由valine突变成isoleucine ICC1882;(//引起一个跨膜蛋白的变化)。

–RTR定位到1.1Mb(12.73-13.83Mb)，其中有26个SNPs；6个SNPs in 未验证的基因，2 in exon,比如p450等；

——滑窗选出区域，区域内寻找SNP-INDEX值高的标记如SNP/INDEL，一般先看功能区SNP上的基因，并对其注释，也就是比对数据库，探究其影响的生物进程。滑窗策略本文使用2M-10K，还可以根据个数来尝试滑数据或者4M-20K，1M-5K；数据库常用的有：NR，GO，KEGG，Uniprot/Swissprot，pfam，EggNog等——

这里写图片描述

100SDW验证图片

这里写图片描述

RTR验证图片

Validation of identified genomic regions

CAPS/dCAPS markers represent cost-effective assays to genotype SNPs in a segregating population.
PCR跑胶图略！

CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)酶切扩增多态性序列　CAPS技术又可称为PCR-RFLP(一种DNA分子标记技术）
SNP的检测一般比较昂贵，往往需要借助仪器，因此，需要简单和准确的基因分型检测方法，可以在没有先进设备的实验室中实施。解决这个问题的方法是用适当的限制性内切酶检测SNP位点，其识别序列已被SNP改变或引入。结合PCR技术，相应的SNP可以分析为切割的扩增多态性序列（CAPS）标记（6）。 CAPS检测的成本通常很低，尤其是当它依赖于常用的限制性内切酶时。
查询酶切位点：http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html
目前软件：dCAPS Finder 2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）–使用方法参看：http://www.360doc.com/content/16/0804/18/35558259_580804357.shtml；SNP2CAPS（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/snp2caps/）
参考文献：SNP2CAPS: a SNP and INDEL analysis tool for CAPS marker development（
https://academic.oup.com/nar/article/32/1/e5/1195347）

补充：
The DNA libraries were sequenced on Illumina MiSeq platform with MiSeq Reagent Kit v2 (500-cycles) (Illumina Inc., San Diego, CA) to generate 250-base pair-end reads.

建库使用Illumina Miseq PE250;

2% agarose gel to get a target insert size of 500–600 bp；

2%胶回收500-600 insert插入片段，回收片段-120多（我不是实验员，不是特别清楚具体数字）=insert sequence。

QTLseq pipeline (http://genome-e.ibrc.or.jp/home/bioinformaticsteam/mutmap,developed by Iwate Biotechnology Research Center, Japan) was used for calculating SNP-index.

使用日本lwate生物技术研究中心开发的QTL-seq流程！

SNP-index (at a position) = count of alternate base/count of reads aligned；

SNP-index=变异位点/total reads。

The positions with read depth <7 in both the bulks and SNP-index <0.3 in either of the bulks were filtered out for ΔSNP-index calculation。

过滤条件：bulks depth <7 && SNP-index <0.3 （文中平均深度测序3X多点，支持reads 数depth <7的都被过滤？？？）

Only SNP positions with ΔSNP-index = 1 (i.e. the allele called in high bulkwas same as that of ICC 4958 while contrastingly different in low bulk) were considered as the causal SNPs responsible for the trait of interest.

low-high越小，即-1选取关联区域，这个结果这么好???找到全是-1的点？还是只看了-1的点，按照0.999/0.99的阈值来找最与性状差异相关的SNP-index值所在SNP，其他点应该也有价值？关联区域内的所有标记和基因甚至都可能成为候选，当然我们一般优先关注差异大的SN-index、或indel-index值为-1/+1的那些标记所在的功能基因，或者非同义突变的SNP/InDex的那些位点所在基因。

The possible effects of the identified SNPs were inferred using
SnpEff v3.0 open source program (Cingolani et al., 2012).

使用snpEff v3.0 NP所在位置判断基因的影响力，一共分为4种；

目前更新到snpeff 4.0!

frameshift_variant|HIGH
stop_gained|HIGH    stop_lost&splice_region_variant&conservative_inframe_deletion|HIGH
splice_donor_variant&intron_variant|HIGH

missense_variant|MODERATE
disruptive_inframe_deletion|MODERATE
disruptive_inframe_insertion|MODERATE
missense_variant&splice_region_variant|MODERATE 

3_prime_UTR_variant|MODIFIER
5_prime_UTR_variant|MODIFIER
intergenic_region|MODIFIER
upstream_gene_variant|MODIFIER
intron_variant|MODIFIER 

synonymous_variant|LOW
splice_region_variant&intron_variant|LOW
splice_region_variant&synonymous_variant|LOW

Cicer arietinum (chickpea)
鹰嘴豆：
基因组链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/?term=Cicer%20arietinum
组装到染色体水平；8 chromosomes;
下载文件大小：GCA_000347275.3_ASM34727v3_genomic.fna 497M
有一个专门预测基因组大小的网站；据说用流式细胞仪的方法预测的，哈哈！！！
这里写图片描述