PNAS：人类、非人灵长类动物和小鼠的大脑皮层折叠、分割和连通性

神经影像学和神经解剖学的进展对皮层组织和进化的基本原理产生了深刻的见解，从而说明了不同物种在健康和疾病中如何更好的充当人类大脑功能的模型。在这里，我们关注的是小鼠、狨猴、猕猴和人类的皮层折叠、分割和连接。不同物种的皮层折叠模式差异很大，皮层折叠的个体变异性随着皮层表面积的增加而增加。这些问题最好的分析方法是使用基于表面的方法，考虑皮层的拓扑结构。皮层组织的许多方面可以通过一次使用一种类型的信息(模态)来揭示，例如皮层髓鞘含量图。然而，准确描绘整个皮层区域的镶嵌需要使用功能、结构、连接性和形态组织的信息的多模式方法。上述4种物种的比较，我们发现皮层区的总数和排列方式存在显著差异，尤其是啮齿类动物和灵长类动物。我们使用数百个个体的高质量多模态包进行了评估，发现半球变异性和双侧不对称性在人类中最为明显。不对称性包括面积大小的差异，但不包括区域特征的差异。使用解剖示踪剂对皮层连接的分析，发现猴子和小鼠中高度分布的连接和广泛的连接权重；使用fMRI的间接测量显示人类也有类似的模式。总得来说，用于探索灵长类和非灵长类动物皮层组织多层面的综合的方法具有很大前景。本文发表在PNAS杂志。

关键词：猕猴|狨猴|神经解剖学|大脑皮层|神经影像学

介绍：

大脑皮层是哺乳动物大脑的主要结构，涉及广泛的感觉、运动、认知和情绪功能。尽管不同物种的大小和形态复杂程度存在很大差异，但所有哺乳动物的皮层结构和功能都有基本的共性。最值得注意的是，大脑皮层是一层薄薄的、分层的灰质，其中包含在结构、连接性、形态和/或功能方面不同的皮层区域的镶嵌。

近几十年来，通过不断增长的强大和互补的实验方法得到了极大的发展，这些方法既有侵入性（主要适用于动物模型），也有非侵入性（广泛适用于人类），基于这些方法我们对大脑皮层是如何组织及如何工作的相关研究更加深入。侵入性解剖学、电生理学和光学方法在广泛的空间尺度（微观、中观和宏观）提供了丰富多样的信息。这些工具中的许多需要复杂的基因操作，因此仅限于基因可控制的物种，特别是小鼠，但最近还有狨猴。一些侵入性方法可以应用于人脑（例如手术干预和尸检组织学），但近年来，这些方法与非侵入性方法相比相形见绌，尤其是MRI。这些互补的侵入性和非侵入性方法有助于大量深入研究物种的皮层结构、功能和连接性的实验。一项新兴研究发现，包括大脑皮层在内的大脑回路，在许多测量方法和各种检测尺度下都极其复杂。事实上，这种复杂性已经远远超过了现代神经科学时代早期人在20世纪末的猜想。

在这里，我们从进化的角度出发，重点关注人类、非人灵长类动物和小鼠，以及一些与大脑皮层有关的一般话题。这些包括

1）宏观形态学和个体变异性，特别是MRI所揭示的；

2）皮层分层、功能组织和双侧对称；

3）皮层连接；连通性尤其重要，由于用于推断长距离连接的方法是间接的，容易出错和产生偏见，所以对人类来说尤其具有挑战性。动物模型为人类大脑中使用的非侵入性方法的验证研究提供了希望。

大脑体积和皮层卷积

不同物种的大脑在大小和皮层卷积的复杂性上存在显著差异，如图1所示。图中展示了4种灵长类、和两种啮齿类动物的大脑。就质量而言，人脑重量是小鼠的3800倍，人脑重量是75万年前从人类系谱分离出的黑猩猩脑质量的4倍。人脑比猕猴大17倍，比狨猴大190倍。人类大脑相对于类人猿的扩张主要发生在过去的100-200万年。

皮层卷积的复杂性范围很广，这反映了众所周知的大脑总体积和解剖比例关系函数。随着大脑体积的增加，皮层下结构（脑干、丘脑、基底节）的体积增加速度比大脑皮层慢。而且皮层下白质的增加比皮层灰质的增加更为剧烈。然而，皮层体积的增加主要反映在扩大的表面积上，因为皮层厚度增加的斜率非常小。当超过临界脑容量(7 g）时，所有物种均为多脑回的，具有皮层折叠指数>1，因为皮层表面积超过组合的皮层下灰质、白质和脑室的最小外表面积。除此之外，随着大脑体积的增加，为了确保大脑皮层与其所覆盖的白质之间的紧密接触，大脑皮层变得越来越复杂。在任何给定的物种（或个体）中，除了大小以外，其他因素如何决定皮层褶皱的模式是不同的，尽管折叠程度不同，但灵长类动物共享许多初级沟，如外侧沟、颞上沟和（除狨猴外）中央沟（图1）。相比之下，来自其他哺乳动物目的脑颅类物种具有非常不同的折叠模式（例如，图1中的水豚）。皮层褶皱在某种程度上与区域边界相关，褶皱模式的主要差异可能反映了灵长类动物与其他哺乳动物区域布局的差异。

图1. 4种灵长类动物和2种啮齿动物的大脑图像(上面一行分别为人脑和黑猩猩，下面一行从左到右为猕猴，狨猴，小鼠和水豚。大小比例(黄色文字)基于大脑重量。比例尺适用于所有图像。

折叠变异性、双侧对称性和脑图谱

使用结构MRI扫描来检查3种脑回灵长类动物的皮层折叠模式，我们发现个体之间（以及同一个体的左右半球之间）折叠的变异性与大脑大小和卷积的复杂性成比例。这些关系在神经生物学和发育方面（例如，与皮层折叠机制相关）都很有意义。在猕猴中个体受试者的折叠模式彼此非常相似，在猕猴中，观察MRI结构象和皮质表面模型观察时，发现个体-受试者折叠模式彼此非常相似，并且与群体平均水平非常相似。此外，左右脑半球通过视觉检查是相对对称的。使用GIFTI和CIFTI数据格式，使用总体平均曲面的双边对称性生成具有良好左右对应关系的标准网格表示。在黑猩猩中，个体之间的折叠差异更为明显，群体平均图谱表面（使用折叠对齐）显示出较少的折叠细节保留。无论是仅使用皮层折叠还是使用区域特征，这些差异在人类中都更加明显。群体平均表面之间的物种差异不仅仅是人类图谱（n=210）与猕猴（n=19）和黑猩猩（n=29）相比使用的受试者数量更多的结果，更是由于折叠变异性造成的真正物种差异。

皮层髓磷脂图

经典解剖学家依赖死后组织学数据的细胞结构分析。现代无创神经成像技术为体内结构技术开辟了新的前景。一种非常成功的方法基于皮层灰质的T1w/T2w比率来估计髓磷脂含量。图2为4种灵长类动物和小鼠的皮层髓磷脂图。在人类和猕猴中，这些基于T1w/T2w的图谱与已发表的死后骨髓结构图谱相似。每种灵长类动物（人类、黑猩猩、猕猴和狨猴）都有6个高髓磷脂区域（红色和橙色），包括：早期躯体运动（1）、听觉（2）、早期视觉（3）、中颞复合体（4）、顶叶（顶内沟）视觉（5）和脾后皮层（6）。这些区域中的每一个都被中度髓磷脂层（黄色和绿色）包围。轻度髓磷脂层（蓝色和靛蓝色）包括大量皮层，这些皮层与前额叶（A）、侧顶叶（B）、外侧颞叶（C）、内侧顶叶（D）和岛叶（E）皮层的高级认知和情绪相关功能有关。通过视觉检查，有大量髓磷脂的区域在狨猴中占最高比例，在人类中占最低比例，在黑猩猩和猕猴中占中等比例，这在中颞视觉区域（4）和顶叶区域（5）中尤为明显。轻度髓磷脂的认知/情感区域表现出相反的进展，在人类中比例最大，在狨猴中比例最小。这些定性评估得到了人类、黑猩猩和猕猴前额叶皮层（使用功能性和结构学标记定义）分数大小的定量测量的支持。

图2. 基于T1w/T2w比率的人类、黑猩猩、猕猴，狨猴，小鼠的髓磷脂图谱。数字表示为高髓磷脂区域，字母为皮层位置。

灵长类动物数据来自群体平均表面排列数据。注意，黑猩猩和猕猴的表面被“过度膨胀”以显示隐藏区域如顶内沟中的髓鞘图案。根据每个物种的百分位数范围进行缩放。小鼠图像基于单个动物的体积分析。

小鼠、猴和人类的皮层分割

长期以来，皮层区域一直被认为是大脑皮层的基本单位，但事实证明，在任何哺乳动物物种中实现一致的分割都非常具有挑战性。许多现存的人类和各种实验动物的分割通常基于结构、连通性和/或功能的差异。大多数已发表的分割是单峰的（例如，纯细胞结构的或静息状态功能MRI（fMRI）），并且基于少数个体（有时仅1个个体的1个半球）。这是有问题的，因为区域边界在受试者和实验室之间通常是微妙的、嘈杂的或不一致的。当多个方法显示分离区域边界的一致性时，分割方案的置信度会增加，当许多个体的结果精确对齐以生成能够说明个体一致性和可变性的概率图时，分割方案的置信度会更高。 图3显示了对小鼠、狨猴、猕猴和人类皮层进行多次分割的最新进展。目前图对小鼠、狨猴、猕猴和人类皮层进行分割的方法有：基于多重免疫细胞化学的41区域（图3A1）分块标记和基于许多架构（包括转基因表达）标记、连接性和视网膜主题映射的43区域（图3A3）等皮层分割。并在图3A2中镜像翻转，以便于与图A1进行比较。这两个分区主要由大的初级和次级躯体感觉和运动区域（SSp、SSs、MOp、MOs）以及初级视觉、听觉、味觉和嗅觉区域（V1、AUDp、GU和Pir）组成。两个方案共有37个区域，大多数区域的名称相同或相似。然而，一些较小区域的大小、形状和相邻关系，甚至对于MOp和MOs等大区域（图3A，红线），存在许多适度的差异，总的来说，这两种小鼠模式构成了迄今为止所有物种中最接近统一一致的皮层分割。

研究最多的猴子是狨猴（图3B）、猕猴（图3C）和枭猴。图3B1和图3B2是狨猴多模态结构分割，分别包含117个皮层区域，在细节上有许多相似之处，但也有许多不同之处。对于猕猴而言，在候选区域的总数和具体安排方面，广泛使用的分割方案之间存在较大差异。PHT00细胞架构分割中有161个区域（图3C1），LV00_FOA00_PHT00复合分割中有130+个区域（图3C2），而Markov M132结构分割中有91个区域。 总的来说，狨猴和猕猴的分割有很多共同点，与小鼠有很大的不同。猴子的皮层面积是老鼠的多倍，还有其他基本的组织差异。在早期感觉区域中，最显著的差异是1）灵长类躯体感觉区域（图3A，3B1，3B2）的带状排列与更圆的小鼠SSp和SSs； 2）灵长类V1是迄今为止最大的主要感觉区域，几乎被单个同心区域V2包围，而与小鼠V1相邻的许多区域的镶嵌相比。猴类在枕骨、顶叶、额叶和颞叶皮层中有大量更高的感觉、运动和多模态关联区域，这些区域在小鼠中不太可能有强的候选同源物，这与关于髓磷脂图的观察结果一致。

在人类中，已经报道了许多泛半球皮层分割方案，早期的例子是布罗德曼经典的47区细胞结构图。其他研究报告了更多的领域，包括早期骨髓结构包含200个区域，并引发了关于人类皮层区域数量的长达一个世纪的争论。近年来，静息状态fMRI已被用于基于“功能连接性”的相似性生成许多单峰但泛半球分割。一种广泛使用的基于fMRI的分割（图2D1）包含两个半球中的356个区域。尽管每个半球有178个区域，但左右半球之间存在明显的不对称（红色箭头），许多地块边界不符合已知的视觉或体感运动区域边界。

图3D2显示了HCP_MMP1.0多模态平均分割，通过以下方法确定了每个半球的180个区域1）使用来自人类连接体项目（HCP）的高质量多模态数据，识别了每个半球的180个区域（或区域复合体）；2）处理数据以最小化伪影、干扰信号、失真和模糊；3）使用“区域特征”（而不仅仅是折叠模式）将数百个受试者的数据精确地对齐到基于表面的图谱中；4）根据与结构、连接性和功能相关的多个模态的组平均数据计算空间梯度；5）要求几乎所有候选区域边界的至少2种模式之间达成一致。重要的是，在地理位置上大致对应于两个半球的位置发现了相同的180个区域。人类皮层中这种高度的双侧对称性（在分割过程中发现但未强制）与图3D1和许多其他已发表的基于静息状态网络的单峰分割中缺少对称伴侣的大量区域形成对比。

图3.四个物种的皮层分割

A｜鼠的两种分割。A1基于多种免疫细胞化学标记。 A2和A3小鼠分割，区域边界是基于许多结构和免疫细胞化学标记加上使用内在光学成像的视网膜色素变性。并且镜像翻转A2。MOp和MOs区域在两个平面图(红线)上的形状和相对大小不同。

B｜绒猴分割。B1基于细胞结构和多种免疫细胞化学标记。B2基于髓磷脂、细胞色素氧化酶和钙结合蛋白标记。

C｜猕猴分割。C1基于细胞结构和SMI-32免疫细胞化学的PHT00分割。C2基于细胞结构、骨髓结构、免疫细胞化学和视网膜形态的复合多模式分割。C3基于细胞架构和SMI-32免疫细胞化学。

D｜人类分割。D1基于静息态fMRI的人类单峰分割。红色箭头显示了左半球和右半球明显的不对称模式。D2基于髓磷脂图、皮质厚度、静息状态fMRI和使用rfMRI的视觉组织的HCP_MMP1.0多模态分割。

人类皮层区域的个体差异性和双侧不对称性

除了群体平均分割，HCP_MMP1.0还准确地识别了数百名个体受试者的皮层区域，使用区域分类器为每个个体的每个表面顶点分配区域标识，方法是检查与之相关的112维特征向量，以匹配学习到的区域。在这里，我们使用所得的个体受试者分割来检查446名受试者的变异性和双侧对称性。我们之前报道过180个皮层区域中的每个区域的表面积在个体之间变化2倍或更多，这与之前基于较少区域和个体的报告一致。这种明显的变异性反映了尺寸估计中的“噪声”，27名测试-再测试受试者（重复扫描）的Dice系数中位数为0.72证明了这一点。

在这里，我们报告了几个关于左半球和右半球分割的发现。我们发现：

1）如图4A所示每个区域的大小在个体的左右半球之间相关（r=0.37±0.13；95%CI[0.35，0.39]）。180个区域中的10个区域的相关性超过了0.6。产生这种相关性的部分原因是，大脑半球的总表面积因个体而异，并且各半球之间存在相关性（r=0.99）。在将每个半球的总表面积作为一个混杂因素进行回归后，左右面积相关性仅略低（r=0.30±0.12；95%可信区间[0.29，0.31]），表明相关性在很大程度上由皮层总面积以外的因素驱动。这些观察表明，无论发育和/或环境因素决定了每个人的每个区域的大小，两个半球似乎都有共同的影响，而不是完全独立。

2）大多数区域（128/180，P<0.05，经多次比较校正）与其他区域（红点）相比，一个半球的平均面积明显更大。具有不对称性，图4A的横轴为不对称指数（L-R）/（L+R），对于绝对值大于0.13的指数的所有区域都是重要的，并且这些区域几乎涵盖了左右相关值的整个范围；1/3的区域（57/180）中它超过0.2，在少数区域（6/180）中超过0.4。因此，许多区域在面积大小水平上显示双边不对称性。评估左半球和右半球各区域的平均皮层厚度和平均面积体积（反映表面积和厚度）的相关性也很有意义。

一个重要的考虑因素是左右不对称和相关性如何随面积大小而变化。小面积的面积变化系数始终很高，并随着面积的增加而急剧下降（fig4B）。小面积的不对称指数往往更高（图4C），但是对于所有面积大小范围内的大多数面积来说，都具有显著的不对称性。最后，左右相关值随面积增加而增加（图4D），但相关值超过0.4，对于大多数面积大于500 mm2的区域和许多较小的区域（面积小于200 mm2）都是显著不对称的。

图4人类HCP-MMP 1.0皮质分割中左、右半球的区域相关性和不对称性。

A｜水平轴上不对称指数([L-R]/[L+R])的散点图，反映了446名个体受试者的左半球和右半球平均表面积的差异，以及左半球和右半球面积大小之间的相关性(垂直轴)。

B｜每个区域的变异系数(SD除以平均值)(分别计算左半球和右半球，然后取平均值),作为平均区域大小的函数(跨半球取平均值)。

C｜作为平均面积大小函数的左右平均表面积不对称指数。52个在多重比较校正后缺乏显著不对称性的区域(蓝点)都具有低不对称性指数(< 0.13)，这些区域包括非常小到最大皮质区域的全部范围。具有显著不对称分数的128个区域几乎跨越了皮质区域大小的全部范围，但较小区域更多。

D｜左右相关值与皮层面积大小。相关值往往随着面积的增大而增大，但对于所有主要的面积范围来说，相关值变化很大(几倍或更多)，并且对于具有显著和不显著不对称指数(红点和蓝点)的区域具有可比性。

连接和皮层连接原理

我们对皮层-皮层连接的基本原理的理解在过去的半个世纪中发生了巨大的变化。在20世纪60年代，相对较少的路径连接相对较少的区域被确定，并且一个吸引人的概念框架包括通过视觉区域的一系列层次结构的单向信息流。在20世纪70年代和80年代，现代路径追踪方法揭示了更多的皮层区域和更多的连接它们的路径，包括双向（互惠）连接，表示广泛的前馈和反馈路径和分层组织。这导致了一个分布式皮层层次结构的呈现，包括10个离散层次级别的32个视觉区域，每个区域平均有10个输入和10个输出。它还包括一个分段连接矩阵，因为当时关于连接权重的定量信息很少，其条目是二进制的（存在或不存在）。

在随后的几年中，已经报道了许多其他的皮层区域和皮层通路，但更重要的是定量估计连接权重的能力。这导致人们认识到，皮层-皮层连接模式在以下两个重要方面更为复杂：1）每个区域的皮层输入和输出的数量通常是先前报告的几倍，2）定量分析表明，连接权重的范围比先前认为的要大很多数量级。

在小鼠中，对19个皮层区域的逆行示踪剂注射进行的分析确定了每个源区域的加权连接（体外标记神经元的分数），包括SSp的7个分区。在得到的19×47加权连接矩阵中（图5A），97%的所有可能存在的连接都得到了识别，连接权重范围跨越4到5个数量级。最近涉及大量小鼠皮质区域和丘脑核的顺行示踪分析，建立在使用类似方法表征猕猴和狨猴连通性模式的早期分析基础上。在猕猴中（图5B），29×91的连接矩阵表明，66%的可能路径确实存在，连接权重再次跨越5个数量级；对于29×29的连接矩阵”，2/3的路径是双向的，并且在双向路径中，连接权重有时会显著不同。类似的原理似乎适用于狨猴报告的55×117连通矩阵。

上述具有离散处理水平的皮层层次的概念的一个重要替代方案是将层次表示为连续变量的模型。在猕猴中，这包括嵌入前馈和反馈逆流组织中的分级层次结构。在小鼠中，有证据表明有一个分级的层次结构，涉及37个皮层区域和24个丘脑核，该层次结构要浅得多，涉及输入和输出的层流模式的差异是复杂的，有时是微妙的，在细节上与猕猴使用的标准不同。在狨猴身上，目前分级组织的证据表明与猕猴有着广泛的相似性，但有必要进行更详细的分析。在人类和猕猴中，基于T1w/T2w的髓磷脂含量图（图2）被认为是解剖学层次的“代表”，该层次也与基于人类基因表达模式的转录变异相关。

在人的相关研究中，无法进行侵入性解剖路径追踪，目前只能通过非侵入性扩散加权MRI方法和静息状态fMRI系统推断长距离连接。这两种方法都受到许多类型的误差和偏差的影响，并且它们估计的真实解剖连接性不同。图5C为识别的12个主要静息态网络。基于与图3D2中相同的HCP多峰分段。该分析提供了先前静息态网络研究中报告的许多网络的和HCP特定的表示。图5C对12个静息态网络和360个皮层区域的分割功能连接性矩阵研究发现，每个静息态网络内的功能连接性高，静息态网络之间的功能连接性程度不同。默认模式（任务负性）网络（DMN）和扣带回网络之间的负相关最为显著。人类功能连接矩阵显示了高度分布的“连接”模式和广泛的“连接权重”（相关值），在这些方面与猴子和老鼠的解剖连接矩阵相似。功能相关性不仅可以反映直接联系，还可以反映间接解剖通路、共同输入，以及神经血管耦合的其他复杂表现，这是一个复杂但仍不清楚的过程。

猕猴和狨猴的研究中迫切需要对功能和解剖连接性之间的关系进行系统、定量的评估，因为它们是解决这些问题的最佳动物模型。十年前，这种方法的原理得到了初步证明。两种模式的数据采集和分析的改进可能会导致更好的策略，使用基于“真实”示踪剂的连接性和从静息状态fMRI相关性推断直接解剖连接性。

图5分割的皮质连接矩阵。

A｜鼠的19 × 47加权连接矩阵，包括SSp的7个分区。

B｜猕猴的29 × 91加权连接矩阵。

C｜顶部为人类HCP_MMP1.0分段的12网络静息状态网络。底部为来自449名HCP受试者的功能连接矩阵。

物种间表面的配准

以上描述和说明的物种间的比较都涉及对每个物种单独分析和显示的数据集。使用基于表面的配准在物种之间进行映射后比较皮层组织，是一种非常值得考虑的方法。这种方法是有希望的，皮层组织的图在拓扑结构上是等价的。考虑到上文讨论的人类皮层区域数量不等的证据(∼180）与猕猴(∼140），在区域到区域对应的级别上不太可能存在完美的拓扑等价。另一方面，许多区域（尤其是早期感觉和运动区域）真正同源性的可能性，以及物种间髓磷脂图谱的广泛相似性，从探索拓扑结构保存的种间信息中可以学到很多东西。先前沿着这些路线所做的努力使用了一种基于位置的方法，该方法基于假定同源的区域或区域的相应边界。由于方法上的局限性，由此产生的“演化扩展”图只是粗略的近似值。可以使用稳固的算法和更强的配准约束来预期改进。

结论

本文讨论了灵长类和啮齿类动物皮层组织和连接的许多方面的进展。在皮层分割方面，在20世纪晚期，猕猴的分割被广泛认为是所有物种中最详细、最准确的分割。在过去的十年中，小鼠和人类皮层在分割方面取得了更大的进展。小鼠的研究进展得益于多模态分析，其中包括使用组织学的结构学、示踪物注射的连接性、电生理学和光学方法的组织和功能表征，所有这些都是在少量动物身上完成的。在高度相似的小鼠分割上的两项独立研究的汇合为这些研究接近共识提供了希望。对于人类而言，MRI方法和“HCP式”数据采集和分析方法的出现对于实现HCP_MMP1.0在个体和群体平均值中的分割至关重要。使用其他高质量数据集和其他方法进行验证显然是可取的，但我们强调需要客观、多模式的方法，在识别真正的区域边界时，该方法能够可靠地处理假阳性和假阴性（与可能反映区域内子区域或明显伪影的过渡不同）。未来的一个高度优先目标是在猕猴和狨猴中实现基于多种模式的泛皮层分割。在各种挑战中，即使是定义明确的皮层区域，其绝对大小和内部组织也各不相同。在一个一致的空间框架中，对许多主题进行强大的多模态分割将引发包括人类相关问题在内各种有趣的问题。在猴身上实现这些目标的进展将取决于数据质量和数据分析的进一步改进。