基因工程-5-目的基因导入受体细胞的方法

目录

本章导读

5.1把目的基因导入大肠杆菌

5.1.1 自然条件下的转化过程

5.1.2感受态受体细胞选择

5.1.3外源目的基因导入到肠杆菌的方法

（1）CaCl2转化法

CaCl2转化法程序

(2）电穿孔转化法

5.1.4 外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞

5.2目的基因导入酵母细胞

5.2.1 PEG介导的酵母转化

5.2.2 金属阳离子介导的酵母转化

5.3 目的基因导入植物细胞

5.3.1 DNA直接转移法

1、化学刺激法

2.电击法

3.显微注射法

4.基因枪法（particle gun）

5.脂质体介导法

6.激光微束介导的基因转化

7.花粉管通道法

5.3.2根瘤农杆菌介导法

（1）Ti质粒的结构组成 

（2）T-DNA的结构与功能

(3)根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子

农杆菌Ti质粒转化机理

T-DNA的加工及转移

T-DNA的复制

T链蛋白复合物的形成

 T链复合物通过细胞膜的转运

VirB蛋白分为五类

小结

（4）T-DNA转移的影响因素

（5）Ti质粒衍生的载体系统

改造原则

转化Ti质粒载体系统的构建

一元载体系统的构建

共整合载体(一元载体）的构建

双元载体系统的构建

辅助Ti质粒(helper Ti)

微型Ti质粒

 二元载体构建及应用

二元载体较一元载体比较

5.4目的基因导入动物细胞

5.4.1外源基因导入离体培养的动物细胞

5.4.2外源基因导入在动物体细胞

（1）显微注射法

（2）逆转录病毒法

​

逆转录病毒的优点和缺陷

（3）体细胞核移植（NT）

体细胞核移植法的优点

（4）精子载体法

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本章导读

外源基因导入受体细胞有多种方法，细胞类型不同，载体不同，导入方法也有差异。本章主要介绍将外源基因导入大肠杆菌细胞、导入酵母细胞、导入植物细胞以及导入动物细胞的不同方法。每种方法都有其独特的优点，但也有不足，因此，选择什么样的方法将外源基因导入受体细胞,需要根据具体情况来确定。

5.1把目的基因导入大肠杆菌

5.1.1 自然条件下的转化过程

 

5.1.2感受态受体细胞选择

限制缺陷型 hsdR-：增大外源DNA的可转化性。

重组缺陷型 rec-：

转化亲和性：用于基因工程的受体细胞必须对重组DNA分子具有较高的可转化性。

遗传互补型 如a-互补：带有与载体携带的选择标记遗传互补的性状，才能使转化成功。

感染寄生缺陷型：有些细菌细胞对生物如人和牲畜有感染和寄生效应，重组DNA分子导入受体细菌，随之受到感染寄生作用，进入生物体，广泛传播。

5.1.3外源目的基因导入到肠杆菌的方法

（1）CaCl2转化法

核心:是将对数生长期大肠杆菌细胞在低温CaCl,水溶液中一段时间，经过处理后大肠杆菌细胞对DNA的吸附能力显著提高，转化效率可达10^7-10^9转化子/ ug DNA。

CaCl2转化法程序

(1)   用100mmol/L的CaCl2处理对数生长期大肠杆菌细胞，制备感受态细胞;

(2）将DNA分子与感受态细胞混合，使DNA黏附在细菌细胞膜表面。

(3）在42℃水浴中热激90 s，致使膜通透性增加，DNA进入细胞，冰浴中恢复1-2 min。

(4）复苏:在营养丰富的培养基上37℃恢复培养45-60 min。

（不能加抗生素，）

(2）电穿孔转化法

电穿孔转化法亦称电转化法或电激法，是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA进入原生质体。

细胞悬浮液中尽量减少导电离子。

 

5.1.4 外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞

有噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程。

phage 在供体裂解中，部分供体DNA被包装，当感染

5.2目的基因导入酵母细胞

酵母转化可使用电激法、PEG法、醋酸锂等。

5.2.1 PEG介导的酵母转化

PEG（聚乙二醇）法的主要原理是利用化学试剂，如聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA）、多聚-L-鸟氨酸(pLO）和磷酸钙等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。

缺点:需要原生质体和细胞再生；转化体中二倍体和多倍体比例高。

5.2.2 金属阳离子介导的酵母转化

醋酸锂（LiAc）诱导转化

PEG加醋酸锂诱导大幅度提高转化效率。

5.3 目的基因导入植物细胞

5.3.1 DNA直接转移法

1、化学刺激法

植物原生质体用PEG、磷酸钙等处理，诱导原生质体摄取外源DNA分子，完成遗传转化过程。

2.电击法

利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上产生瞬时通道。

3.显微注射法

利用显微注射仪将外源DNA分子直接注射到细胞质或细胞核，实现外源基因的转移。

目前有3种细胞固定技术:琼脂糖包埋法，多聚L-赖氨酸黏连法，吸管支持法。

4.基因枪法（particle gun）

将外源DNA包裹在微小金粒表面，高压作用射入受体组织和细胞内部。

 基因枪的步骤：DNA微弹的制备；靶外植体材料准备；DNA微弹轰击；轰击后外植体的培养。

5.脂质体介导法

利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把外源DNA的脂质体转入受体细胞。

6.激光微束介导的基因转化

将激光引入光学显微镜聚焦成微束，细胞膜上形成自我愈合小孔，使培养基的DNA流入细胞。

7.花粉管通道法

授粉后使外源基因沿着花粉管渗入，通过珠心通道进入囊胚，转化不具备正常细胞壁的卵。

5.3.2根瘤农杆菌介导法

根癌农杆菌（Agrobacterium tume faciens）广泛侵染双子叶植物和裸子植物。

根据根癌农杆菌诱导植物细胞形成的根瘤中冠瘦碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型( octopinetype）、胭脂碱型(nopaline type）和农杆碱型( agropine type）3种类型。

（1）Ti质粒的结构组成 

根瘤农杆菌内致瘤质粒（tumor inducing plasmid），简称Ti质粒。

当根瘤农杆菌感染植物时，菌体本身不进入植物细胞内，仅Ti质粒一部分“T-DNA”DNA片段进入寄主细胞并插入基因组中，T-DNA中的基因利用植物的酶系统进行转录和翻译，其表达的产物可以诱发植物产生肿瘤。