【中科院】分子生物学-朱玉贤第四版-笔记-第 9 讲重组 DNA 克隆技术

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分类专栏：分子生物学文章标签：深度学习

于 2022-05-14 00:23:23 首次发布

本文链接：https://blog.csdn.net/zea408497299/article/details/124711423

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本文详细介绍了重组DNA克隆技术，包括DNA分子的切割与连接、克隆载体和表达载体的选择与功能，以及基因工程的核心步骤。重点讨论了限制性内切酶、DNA连接酶、克隆载体如质粒的特性，以及蓝白筛选法在克隆过程中的应用。此外，还提及了λ噬菌体、粘粒和YAC等不同类型的载体。

摘要由CSDN通过智能技术生成

6. 重组 DNA 克隆技术

设想你是一位 1972 年的遗传学家，想从分子水平研究真核基因的功能。例如，你对人生长素 (hGH) 基因的结构和功能感兴趣，那么该基因的序列是什么？其启动子是怎样的？哪些蛋白或者转录因子与该基因相互作用？基因发生了什么变化导致垂体功能减退性侏儒症？如何得到足量的基因进行研究？

基因克隆技术，又叫重组 DNA 克隆技术，能将外源 DNA 与载体 DNA （小的细菌 DNA 或者噬菌体 DNA 等）连接起来，并将这些重组分子转入宿主细胞（细菌等），通过宿主细胞的大量扩增复制外源 DNA。
重组 DNA 克隆技术主要包括 DNA 分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和 PCR 扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

克隆

在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有 相同基因型 的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子 (monozygotic twins) 便是属于同一克隆。
在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞 (progenitor cell) 分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。
在 分子生物学 上，人们把将外源 DNA 插入具有复制能力的载体 DNA 中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。

基因工程

★ 限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶能够识别 DNA 上的特定碱基序列并从这个位点切开 DNA 分子。
第一个核酸内切酶 EcoRⅠ 是 Boyer 实验室在 1972 年在大肠杆菌中发现的，它能特异性识别 GAATTC 序列，将双链 DNA 分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
1978 年诺贝尔生理学或医学奖共同授予 Werner Arber, Daniel Nathans 和 Hamilton O. Smith, 表彰他们“发现限制酶及其在分子遗传学问题上的应用”。

★ 克隆载体 (Cloning vector)

重组后的 DNA 只有将它们连接到具备自主复制能力的 DNA 分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。
具备自主复制能力的 DNA 分子就是分子克隆的载体 (vector)，分为克隆载体和表达载体。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。

● Cloning in E.coli ：酶切 → 连接 → 转化 → 筛选 → 扩增

DNA 导入细胞的过程：原核生物叫转化 transformation，真核生物叫转染 transfection。
细菌有质粒不相容的特性，只要有一个碱基不同，就不会存在于同一个克隆中。
质粒的不相容性（plasmid Incompatibility）指在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能在同一宿主细胞系中稳定共存的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存。

★ Restriction Endonucleases（限制性内切酶）

限制性识别位点 (Restriction-recognition sites) 是由各种限制性内切核酸酶识别和切割的短 DNA 序列。
三种类型：
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型：第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
- Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主 DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的水解。
- Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的 DNA 的水解。
- Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。

● 限制性内切酶酶切位点是具有中心对称的 回文序列。

回文序列：如果一个（单链）核苷酸的序列和它的反向互补链的序列一样，那么这个核苷酸序列就是回文序列。较长的回文结构容易转化成发夹结构，可能有助于DNA与特异性DNA结合蛋白结合。

● 切割 DNA 产生粘性末端或平末端

平末端 Blunt ends: paired base sequences at the ends of DNA.
粘性末端 Sticky ends: unpaired base sequences at the ends of DNA. 5’突出端、3’突出端
切割后产生 2 个末端基团：5’-Pi 和 3’-OH

★ Isocandamers 同尾酶：产生相同的末端。

2 个同尾酶产生的片段连接后大多数 无法再次被切割。
AgaⅠ（A/CCGGT）和 AvaⅠ(C/CCGGG)。
所有产生平末端的酶都是同尾酶。
参考搜索：常见同尾酶
可以再次切割的少数同尾酶，如 BamHⅠ （G/GATCC）和 BglⅡ (A/GATCT) 可以被 Sau3AⅠ（5’▼GATC3’）切割。
同尾酶克隆：