Oxford Nanopore Technologies工具之Medaka

目录

前言

一、Medaka是什么？

二、使用步骤

1.安装

(1)conda安装

(2)pip安装

2.快速使用

(1)核心参数"-m"

(2)生成一致性序列

(3)鉴别单倍体突变

3.高阶应用

(1)其他用法

(2)ARTIC分析流程

总结

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前言

随着三代纳米孔测序技术的不断发展，Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司在持续更新其测序试剂耗材(比如发布R10版本的Flow cell和Kit14系列测序试剂)的同时，也在同步更新其配套分析软件，如碱基识别软件Guppy/Dorado/Bonito、碱基修饰识别软件Remora、测序控制软件MinKNOW、一致性序列生成软件Medaka等。纳米孔测序技术虽然有着便捷、实时、读长长等特点，但其本身存在一定的测序错误。ONT官方已经发布了多个版本的Medaka，该工具基于修正序列(sequence correction)来生成一致性序列和鉴别突变。

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一、Medaka是什么？

medaka is a tool to create consensus sequences and variant calls from nanopore sequencing data. This task is performed using neural networks applied a pileup of individual sequencing reads against a draft assembly. It provides state-of-the-art results outperforming sequence-graph based methods and signal-based methods, whilst also being faster.

这是ONT官方对Medaka的基本定义，目前已更新至1.7.3版本。该软件的更新几乎与ONT测序芯片和测序试剂的更新迭代同步。比如，ONT发布了最新的R10.4.1芯片和E8.2(Kit14系列)测序试剂不久，Medaka就随之更新，以支持上述最新测序试剂耗材产生的测序数据的分析。

该软件最大的特点就是分析速度快且无需读入原始测序电信号fast5文件。仅需fasta或fastq文件即可开始分析。与ONT早期突变识别工具Nanopolish相比，速度提升极大。

Features

• Requires only basecalled data. (.fasta or .fastq)
• Improved accuracy over graph-based methods (e.g. Racon).
• 50X faster than Nanopolish (and can run on GPUs).
• Includes extras for implementing and training bespoke correction networks.
• Works on Linux and MacOS.
• Open source (Mozilla Public License 2.0).

二、使用步骤

1.安装

可参考其Github网页进行安装，地址为https://github.com/nanoporetech/medaka.

(1)conda安装

在Terminal中输入如下命令即可安装：

conda create -n medaka -c conda-forge -c bioconda medaka

(2)pip安装

另一种便捷的安装方式是使用pip。但要注意的是首先提前安装依赖的其他软件，包括：

• samtools
• minimap2
• tabix
• bgzip

然后再运行如下命令：

pip install medaka

其他安装方式可参考Github网页。

2.快速使用

(1)核心参数"-m"

Medaka基于序列修正来生成一致性序列和鉴别突变。前面提到，ONT的测序准确度虽然一直在提升，但其长读长序列仍存在一定错误，因此仍需进行校正操作以提升下游分析的准确性。不论是生成一致性序列还是鉴别突变，都需要向软件提供"-m"参数及具体模型。该参数与测序使用的碱基识别软件版本(一般是Guppy)、碱基识别模型(fast/hac/sup)、测序芯片(R9或R10)、测序试剂(Kit9、Kit10、Kit12或Kit14)和测序仪(MinION/GridION/PromethION)等密切相关。其基本模式为：

{pore}_{device}_{caller variant}_{caller version}

比如r941_min_fast_g303可以处理的数据应满足如下标准：在MinION或GridION测序仪上使用R9.4.1芯片上测序且用Guppy v3.0.3 快速碱基识别模型(fast)产生的测序数据。 再比如，r941_prom_hac_g507可以处理的数据应满足如下标准：在PromethION测序仪上使用R9.4.1芯片上测序且用Guppy v5.0.7高准确度识别模型(high accurate)产生的测序数据。

可使用如下命令来查看Medaka支持的模型。当实际测序使用的Guppy版本与Medaka模型不一致时，选择的Medaka模型中的Guppy版本不得高于测序使用的Guppy版本。

medaka tools list_models

运行完上述命令以后可以得到如下模型列表，还会看到诸如r941_min_sup_variant_g507等包含variant关键词的模型，这些模型用于鉴别基因组突变。

(2)生成一致性序列

可使用medaka_consensus来生成一致性序列。基本输入包括拼接后的基因组草图，拼接时使用的fastq或fasta文件以及匹配的model文件，基本使用方法如下：

NPROC=$(nproc)
BASECALLS=basecalls.fa
DRAFT=draft_assm/assm_final.fa
OUTDIR=medaka_consensus
medaka_consensus -i ${BASECALLS} -d ${DRAFT} -o ${OUTDIR} -t ${NPROC} -m r941_min_high_g303

生成的一致性序列在-o指定的目录里。这里需要注意的是，基因组草图应使用拼接软件Flye(https://github.com/fenderglass/Flye)生成。

(3)鉴别单倍体突变

可使用medaka_haploid_variant来鉴别细菌或病毒基因组突变。基本输入包括参考序列、测序fastq或fasta、匹配的model文件等，基本命令行如下：

medaka_haploid_variant -r ${ref} -i basecalls.fq -m r941_min_sup_variant_g507 -t 12 -o ${name}_medaka

会在指定目录里产生medaka.annotated.vcf文件。需要注意的是，Medaka一般只能鉴别consensus水平的突变，如果想要鉴别低频的宿主内变异，需要使用其他软件如LoFreq、VarScan2或Bcftools来进行。

3.高阶应用

(1)其他用法

Medaka除上述使用方法外，还支持其他命令行调用方式：

比如medaka consensus和medaka snp或medaka variant连用可鉴别基因组突变，注意调用命令行时medaka与其他命令中间要加空格。

(2)ARTIC分析流程

新冠病毒肆虐全球时，ONT和一些科学家联合发布了针对新冠病毒扩增子测序的分析流程ARTIC，用户可选择使用该流程内置的Medaka软件(主要调用medaka consensus、medaka variant和medaka tools annotate )完成相关分析。

总结

本文简单介绍了Medaka的使用方法，对Medaka的GPU加速和并行计算并未提及，有机会会在以后的文章中继续交流。