体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆

2015年的时候看到这样篇论文，了解到Cas9可以进行体外酶切。

清华大学生命科学学院朱听研究员课题组在《自然-通讯》上在线发表了题为《CATCH技术实现大型基因簇一步法靶向克隆》（Cas9-Assisted Targeting of Chromosome segments CATCH enables one-step targeted cloning of large gene clusters）的论文，首次体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆。

分子克隆技术已被广泛应用于现代生物学的各个领域，但传统的PCR（聚合酶链式反应）技术通常很难一步得到15 kb以上的片段，传统的限制性核酸内切酶识别位点仅6-8个碱基，对生物基因组不能有效实现特异性，因此对于较长目标片段的克隆或合成始终存在阳性率低，步骤复杂，成本高等问题。近年来人们在细菌中发现的CRISPR系统可以实现对外源序列的特异性识别和有效切割，在此基础上，科学家们开发出许多基因编辑、基因表达调控，体内成像等工具。然而对该系统的体外应用则鲜有报道。朱听课题组利用体外转录制备的sgRNA和表达纯化的Cas9蛋白特异性酶切目标全基因组，并通过同源序列互补将长达100 kb的目标片段一步连接到细菌人工染色体上实现特异性克隆。通过脉冲场电泳可以清晰观察到目标大片段从全基因上的有效分离，其克隆效率可与普通短片段克隆相当。
https://www.nature.com/articles/ncomms9101.pdf