噬菌体展示抗体库的兼并引物设计

噬菌体展示抗体库，第一步先是通过免疫相关模式动物，取得其PBMC或者脾器官；第二步反转录mRNA为cDNA，然后以cDNA作为模板进行pcr扩增，这里通常是做scfv较多，所以一般进行两步overlapping pcr或者设计同源臂直接同源重组。传统抗体库筛选是构建免疫细胞的杂交瘤细胞，然后进行体外扩增表达，优点是产生的抗体为天然抗体，缺点是构建的杂交瘤细胞库数量较少，一次需要多只免疫动物，而且需要培养细胞，换液等频繁操作，费时费力不说，还浪费钱。噬菌体展示优点就是快，库容量大，省事省力，节约资金，但抗体库构建的好不好跟很多原因相关，最直接的就是兼并引物设计不合理，不能覆盖所需要的抗体，扩增出其他类型的抗体等。

  通过查阅已有噬菌体展示的兼并引物对，我们发现大部分引物遵从以下三个

规则（经验之谈，不作为噬菌体展示必须遵守的原则）：

1. 兼并核苷酸在一条引物中只出现一次（有些也有两个）

2. 兼并核苷酸只包含两种核苷酸:M=A/C, Y=C/T, S=C/G, R=A/G, W=A/T，K=G/T

一、获取目的抗体序列

  如可在NCBI中获取兔igg抗体，通常我们得到的igg的轻链和重链，同时我们需要注意的是重链通常有alpha、δ、e、gamma、μ等组成，而igg重链是gamma，所有抗体的轻链由λ或者k组成,但注意部分标记λ或者k的不一定指的是抗体序列。

因此NCBI关键词搜索对于重链是rabbit IGG或者rabbit Ig Gamma，对于轻链则没有要求，因为λ或者k在所有抗体中都出现了,所以轻链关键词可为rabbit light或者rabbit KAPPA或者rabbit LAMBDA。所有的轻链和重链，可通过图左上角选择动物源的mRNA来减少序列输出量，简化程序计算时间。

二、获取轻链和重链

heavy = []
heavyseq = []
i = 0
a = ""
name = []
f = open("E:\资料\课题\数据挖掘\兔scfv抗体引物设计\兔重链light and heavy DNA序列.txt","r")
f1 = open("E:\资料\课题\数据挖掘/兔scfv抗体引物设计/heavy DNA序列.txt","w")
for line in f.readlines():
  if ">" in line:
    i += 1
    name.append(line.upper())
    if i > 1:
      if "RABBIT" in name[-2] or "ORYCTOLAGUS" in name[-2]:
        if "HEAVY" in name[-2]:
          if "IGG" in name[-2] or "GAMMA" in name[-2]:
            if a not in heavyseq:
              heavy.append([name[-2],a])
              print(name[-2], a)
              f1.write(name[-2] + a + "\n")
              heavyseq.append(a)
    a = ""
  if ">" not in line:
    a += line.replace("\n", "")

f.close()
f1.close()


light = []
lightseq = []
i = 0
a = ""
name = []
f = open("E:\资料\课题\数据挖掘/兔scfv抗体引物设计/兔重链light and heavy DNA序列.txt","r")
f1 = open("E:\资料\课题\数据挖掘/兔scfv抗体引物设计/light DNA序列.txt","w")
for line in f.readlines():
  if ">" in line:
    i += 1
    name.append(line.upper())
    if i > 1:
      if "RABBIT" in name[-2] or "ORYCTOLAGUS" in name[-2]:
        if "LIGHT" in name[-2] or "KAPPA" in name[-2] or "LAMBDA" in name[-2]:
          if a not in lightseq:
            light.append([name[-2],a])
            print(name[-2], a)
            f1.write(name[-2] + a + "\n")
            lightseq.append(a)
    a = ""
  if ">" not in line:
    a += line.replace("\n", "")

f.close()
f1.close()

三、通过bioedit等可视化软件观察引物截取片段附件的核苷酸保守性并截取相应的F端引物盒R端引物序列

heavyF = []
for a in heavy:
  if "AGGAGTCCG" in a[1]:
    m = a[1].index("AGGAGTCCG")
    heavyF.append(a[1][m-10:m+11])

lightF = []
for a in light:
  if "TGACCCAG" in a[1]:
    m = a[1].index("TGACCCAG")
    lightF.append(a[1][m-4:m+14])

四、多条不同序列的兼并引物设计

from tqdm import tqdm
primer1 = heavyF
primer = []
for a in primer1:
  if a not in primer:
    primer.append(a)

M = ['A', 'C']
Y = ['C', 'T']
S = ['C', 'G']
R = ['A', 'G']
W = ['A', 'T']
K = ['G', 'T']
mutipre1 = []
mutipre2 = []
for a in tqdm(range(len(primer) - 1)):
  for b in range(a + 1, len(primer)):
    if (primer[a] != '') & (primer[b] != ''):
      print(primer[a], primer[b])
      for c in range(len(primer1[0])):
        if (primer[a] != '') & (primer[b] != ''):
          print(primer[a][c], primer[b][c])
          if primer[a][0:c] + primer[a][c + 1:] == primer[b][0:c] + primer[b][c + 1:]:
            print(primer[a][0:c] + primer[a][c + 1:])
            if (primer[a][c] in S) & (primer[b][c] in S):
              mutipre1.append(primer[a][0:c] + 'S' + primer[a][c + 1:])
              print(primer[a][0:c] + "S" + primer[a][c + 1:])
              primer[a] = ''
              primer[b] = ''
            elif (primer[a][c] in M) & (primer[b][c] in M):
              mutipre1.append(primer[a][0:c] + 'M' + primer[a][c + 1:])
              print(primer[a][0:c] + "M" + primer[a][c + 1:])
              primer[a] = ''
              primer[b] = ''
            elif (primer[a][c] in Y) & (primer[b][c] in Y):
              mutipre1.append(primer[a][0:c] + 'Y' + primer[a][c + 1:])
              print(primer[a][0:c] + "Y" + primer[a][c + 1:])
              primer[a] = ''
              primer[b] = ''
            elif (primer[a][c] in M) & (primer[b][c] in R):
              mutipre1.append(primer[a][0:c] + 'R' + primer[a][c + 1:])
              print(primer[a][0:c] + "R" + primer[a][c + 1:])
              primer[a] = ''
              primer[b] = ''
            elif (primer[a][c] in W) & (primer[b][c] in W):
              mutipre1.append(primer[a][0:c] + 'W' + primer[a][c + 1:])
              print(primer[a][0:c] + "W" + primer[a][c + 1:])
              primer[a] = ''
              primer[b] = ''
            elif (primer[a][c] in K) & (primer[b][c] in K):
              mutipre1.append(primer[a][0:c] + 'K' + primer[a][c + 1:])
              print(primer[a][0:c] + "K" + primer[a][c + 1:])
              primer[a] = ''
              primer[b] = ''

for a in primer:
  if a != '':
    mutipre2.append(a)

mutipre3 = mutipre1 + mutipre2
mutipre3