【无标题】新冠病毒变异株检测——荧光定量PCR检测技术开发

一、新冠病毒简介

     2019新型冠状病毒（2019-nCoV，世卫组织2020年1月命名；SARS-CoV-2，国际病毒分类委员会2020年2月11日命名）简称“新冠”。

        冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。

      2021年1月15日，英国已发现了一种来自巴西的变种新冠病毒 。2月21日，据俄罗斯报道，在印度各地发现了多达240种新冠病毒毒株的新型变种 。3月30日，中国—世卫组织新冠病毒溯源联合研究报告在日内瓦发布，报告显示，武汉华南海鲜市场不是新冠病毒最初来源地。.......此处省略一万字，可自行百度。

二、新冠病毒检测的本质

     

      核酸（DNA或者RNA）是生物体的遗传物质，具有较好的保守性、完整性和储存遗传信息的功能。因此可以通过检测样本的核酸来判断是否有新冠。核酸我们大家都知道是由AGCT(或者AGCU)组成，每个位置有4种可能的碱基，可以是AGCT中的任何一位。假设一个物种有100个核酸碱基组成，那么至少有4的100次方的序列可能，这已经是天文数字了。然而真实的新冠病毒有29763bp，如果随机突变的话有4*29763次方的组合排列，每一种排列都可能产生一种新的序列信息，因此如果想要通过检测核酸去针对的检测相应的新冠毒株是比较困难的。我们必须尽可能多的找到相应毒株的核酸序列，从中找到相应株中都存在的保守序列，同时在其他株中不出现，方能完成特异性检测。

三、新冠病毒检测技术——荧光定量PCR

      实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量,通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据,下图为qpcr反应及检测过程示意图:

     通常qpcr设计引物长度在18-30bp之间，扩增片段在75-250bp之间。qpcr过程扩增产物短，扩增特异性强、效率高，能极大扩增病毒核酸信号，核酸检测在新冠流行期间发挥了重要的防疫作用。

四、新冠变异株核酸序列准备

      第一步找到NCBI上的新冠数据库：

       第二步筛选新冠变异株序列并下载：

新冠变异株	Alpha	Beta	Delta	Gamma	普通株
Pango lineage	B.1.1.7	B.1.351	P.1	B.1.617.2	-

        通过Pango lineage号我们能迅速的找到新冠常见的四种变异株，为了我们后期的算法方便，也为了进一步对数据进行高质量过滤简化处理，我们可以通过下面三个参数进行筛选:第一个为特殊符号，测序过程对于测序碱基不能确定的会以N表示，我们选择特殊符号为0，那么表示本次筛选到的是高质量的测序结果;第二个为基因组的完整度，我们选择complete，表示完全匹配，测序深度很高，和参考基因组无缝拼接;第三个为Pango lineage，我们就不用多讲了，想要哪个变异株就输入哪个号。

       

       下载后的新冠阿尔法毒株有上万条序列，每一条序列表示一个完整新冠基因组，总大小有1.9G的数据量。贝塔株较小有7.6M，德尔塔有将近70M，伽马有115M的数据量，这些数据量的处理最好需要适合生物信息学的高配置电脑去处理。

     

 五、设计原理分析

Alpha：α1，α2，α3，......αn

Beta：β1，β2，β3，......βn

Delta：δ1，δ2，δ3，......δn

Gamma：γ1，γ2，γ3，......γn

Normal：Alpha，Beta，Delta，Gamma 和其他株

       如上，下载后的序列中，包含NCBI上已经审核提交的所有的完整的相应株的序列。假如你要设计pcr的引物长度为20bp，首先从Alpha开始，你设计的5‘端和3’端引物必须同时出现在Alpha株中所有的其他序列中。有人会问为什么同是阿尔法的病毒不同序列会不一样，他们不都是阿尔法株吗？也就是说α1不完全等于α2，α2不完全等于α3，以此类推，有可能在所有的α中，没有任何两个是完全一样的，理论上可能出现这种情况，正如同上面我们说到的新冠检测本质一样，其碱基基数太大，而SNP(也叫单核苷酸突变位点)是很容易在培养的病毒或者流行的病毒中发现的。我们知道新冠为单链RNA病毒，单链相比于双链更加容易发生碱基突变，但这并不妨碍变异株还是新冠病毒的事实，因为只有当突变到达一定的比例之后才能定义为新物种。言归正传，当序列满足同时出现在所有的阿尔法株时，还需要满足其特异性检测，也就是其引物一定不能出现在贝塔、德尔塔、伽马中。对于贝塔、德尔塔、伽马的引物设计如同阿尔法毒株引物设计思路。

       下一步就是如何实现上面的思路，qpcr扩增的酶具有高保真性，也就是说当引物序列和待检测的样本核酸序列完全匹配时才能进行扩增。因此我们所涉及的序列是具有特异性、唯一性。我们借鉴宏基因组测序分析方法——kermer，通过20bp的kermer，我们可以将一条序列全部截成长度为20bp的连续序列，如我们的序列长度29763bp，则可以生产29763-20+1=29744条长度为20bp的碱基集。

       好了，今天先讲到这里，欢迎订阅下期文章。顺便再做下推广：新的宏基因组在线分析网站地址为：www.xiaohongwgsa.top，感兴趣的可以查看！欢迎扫码定期订阅相关文章！