SAM/BAM相关的进阶知识

1. samtools和picard的排序问题
samtools和picard都有对SAM/BAM文件进行排序的功能，一般都是基于坐标排序(还提供了-n选项来设定用reads名进行排序),先是对chromosome或contig进行排序，再在chromosome/contig内部基于start site从小到大排序，对start site排序很好理解，可是对chromosome/contig排序的时候是基于什么标准呢？
基于你提供的ref.fa文件中的chromosome/contig的顺序。当你使用比对工具将fastq文件中的reads比对上参考基因组后会生成SAM文件，SAM文件包含头信息，其中有以@SQ开头的头信息记录，reference中有多少条chromosome/contig就会有多少条这样的记录，而且它们的顺序与ref.fa是一致的。


当使用samtools或picard对SAM/BAM文件进行排序时，这些工具就会读取头信息，按照头信息指定的顺序来排chromosome/contig。所以进行排序时需要提供包含头信息的SAM/BAM文件。

@HD：表示参考基因组的排列情况
@SQ：参考序列说明；LN：长度，这里的长度与ucsc.hg19.fasta.fai中的长度是一样的。
@PG：使用的比对程序说明，可以看到使用的参考基因组：hg19还是hg38
@RG：比对上的序列（read）说明

第二部分：联配必要信息，每一行有12行，通过Tab键分割。

第一列：rname（Qname）即为fq对应的read ID。这一列代表read的名字（比对片段的编号）
第二列：FLAG 比对信息位。

想要读懂他的一个关键点是将flag值转换为一串由0,1组成的二进制码，这一串二进制数中的每一个

位（bit）都代表一个特定的信息，他一共有12位，所以一般会用一个16位的整数来代表，这个整数的

值就是由12个0或1组合计算得出的。因此他的数值范围在0~2^12（2048）

举一个例子，FLAG=77=000001001101(左边补5个0)=1+4+8+64
FLAG包含信息：PE reads、read比对不上参考序列，它的配对read也比对不上，它是read1

第三、四列：position 分别是RNAME(参考序列染色体名)和POS（比对位置，从对应染色体的第1位开始往后计算）

第五列：MAPQ(mapping quality) 比对质量值

这个值告诉我们这个read比对到参考序列上这个位置的可靠程度。相当于Q

第六列：CIGAR 比对信息（雪茄字符串）

它用数字和几个字符的组合形式记录了read比对到参考序列上的细节信息，读起来比FLAG直观友好很多，只是

记录的信息不同。例子：33S117M，意思是在比对的时候这条read开头的33bp被跳过了（s），紧接其后的117bp

则比对上参考序列（M）。这里的S意思都是soft clip。

CIGAR的标记字符有：MIDNSHP=XB

第七、八、九列：Mate information

RNEXT：配对read所比对到的染色体（pe才有）
=号代表比对到了相同的染色体上。

PNEXT：配对read所比对到的位置（pe才有）

TLEN：插入片段的长度：如果所有段都映射到相同的参考序列，则TLEN的绝对值等于模板的映射末端与模板的映射起始点之间的距离，包括端值（即end-start + 1）。当多段模板的第一个或最后一个段未映射时，或者当两个映射到不同的参考序列时，它将设置为0。

第十、十一列：
SEQ：read序列
QUAL：read质量值

这两列相当于fastq的二四行

第十二列：metadata 元信息