基因工程的关键步骤是目的基因的获取与制备，本章详细阐述了四种方法：基因文库筛选、电子克隆、PCR扩增及蛋白质工程。基因文库分为基因组文库和cDNA文库，通过载体连接和筛选获取目的基因。电子克隆利用基因组数据和EST序列拼接获取新基因。PCR技术中，常规PCR、反向PCR和RACE-PCR等用于扩增和鉴定目的基因。这些技术在基因表达分析、基因诊断和功能研究中发挥重要作用。
本章导读
目的基因的获取与制备是基因工程操作中最关键的环节。本章介绍了四种制备目的基因的方法，包括从基因文库中筛选目的基因，电子克隆目的基因，通过PCR技术扩增目的基因以及通过蛋白质工程改建目的基因等。其中PCR技术既可以克隆和扩增目的基因，又可以研究基因的表达和定位，还可以实施定点突变，是一种强大的基因操作工具。
目录
4.1基因文库获取目的基因
基因文库（gene library）指细菌中增殖来自某一生物的染色体DNA或cDNA所形成的全部DNA片段克隆的集合体。
根据外源片段的来源不同，可以将基因文库分为基因组文库（genemic DNA library）和cDNA文库（complementary DNA library）.、
4.1.1基因组文库的构建与筛选
基因组文库指把某种生物的基因组DNA全部提取出来，切成适当大小的片段，分别与载体连接构成重组DNA分子后，再导入适宜的宿主细胞，形成克隆。这些克隆汇集之后，应包含基因组中的各种DNA序列，每份DNA序列至少有一份代表。这些克隆片段的总汇，叫基因组文库。
4.1.1.1基因组文库构建过程
- 细菌染色体大分子DNA的提取和大片段DNA的制备；
- 载体DNA的准备；
- 载体与基因组大片段DNA的连接；
- 体外包装基因组DNA文库的扩增；
- 重组DNA的筛选和鉴定；
DNA的制备
保证基因组DNA文库的完整性，减少DNA的丢失，尽量保证DNA有足够的长度，片段之间有重叠。
采用低熔点琼脂糖包埋固定法。直接将真核细胞包埋在低熔点琼脂糖中，在凝胶块中完成细胞的裂解和蛋白质消化步骤，制备大分子DNA（HMW-DNA）。长度可达500kb。
DNA的切割
物理方法：
机械力和超声波将DNA打断。
生物化学法：
限制性核酸内切酶降解DNA。
然而用机械或超声波的方法切割 DNA，往往造成DNA末端是平头末端或带有一个短的单链尾巴，这就需要首先用DNA聚合酶Ⅰ的 Klenow片段将DNA末端补平，然后再与载体连接重组。对于用限制性核酸内切酶消化的DNA片段，因为其本身带有互补的黏性末端，可以通过用同一种酶或同尾酶酶切载体，直接与载体进行黏性末端的连接，无需其他修饰或处理。
载体和受体的选择
构建基因组文库所用的载体通常有三种:λ噬菌体、柯斯质粒及人工微小染色体YAC和BAC。
有时候为了构建亚克隆文库，也会用到质粒作载体。除YAC作载体必须用酵母细胞作为受体细胞外，其余载体都用大肠杆菌作为受体细胞。
λ噬菌体
替换型载体有非必须的填充序列，进行填充便于包装。
用于小基因组物种的克隆起到重要作用；
插入片段大小为20kb；
有利于利用分子杂交的方法进行筛选。
黏粒cosmid
带有λ噬菌体的cos序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因构成的。
必须有cos位点才能够进行包装。
主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。
插入40kb。
人工微小染色体YAC
酵母人工染色体文库和细菌人工染色体文库。
酵母染色体形式存在。大肠杆菌的F质粒存在。达到100KB-1GB.
用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序，在基因组研究中越来越广泛。
人工染色体文库：BAC装载200kb,YAC装载400kb。
基因组DNA文库载体制备
要求：纯度高；去磷酸效果好。
纯度不高含有大量细菌基因组DNA，出现大量插入片段为细菌基因的DNA假阳性菌落。
载体去磷酸化是为了提高连接效率，在同一个链接组分中自体连接速度过高。
连接方式：载体自连、载体和基因组DAN连接、DNA片段的自连和基因DNA片段之间的连接。
在电转化和包装侵染过程中，选择转化效率高的感受态细胞或效价高的细胞；
基因组文库的保存
噬菌体文库；
BAC文库；
4.1.1.2 基因组文库完整性测定
完整性指，所有基因DNA片段可形成完整基因组；所有克隆所携带的DNA片段频率是相同的。
公式：N=ln(1-p)/ln(1- f)
式中，N为一个完整基因组文库所应该包含的重组克隆总数;p为该文库理论上囊括基因组所有片段的概率，如果是完整文库，则此概率一般规定为99%甚至99.99%;f 为重组克隆平均插入片段的长度与基因组 DNA总长度的比值。
例如，人的基因组总长度为3×10^9bp，p =99%，假如以噬菌体作载体构建基因组文库，插入片段平均长度为1.7×10^4bp，则 f =1.7×10^4/(3×10^9)。代入上述公式，算出
N=ln(1-0.99)/ln[1-1.7×10^4/(3×10)]=8.1×10^5
质量检测
平均插入片段长度：通过PFGE电泳检测一定数量的重组子插入片段的平均值。
插入效率：检测的克隆占总数多少。
覆盖倍数:基因组覆盖倍数=平均插入片段长度*克隆数/基因组DNA的长度（一般是约数）。
基因组覆盖度：克隆覆盖基因组的范围，选择一定数量的单拷贝基因做探针来筛选文库，所有探针检测阳性，说明覆盖度大。
基因组覆盖倍数=阳性总数/探针总数。
文库构建的两个策略：
部分酶切或随机切割的方法打断染色体DNA，以保证克隆的随机性，保证每段基因组DNA在文库中出现的概率均等；
提高文库
4.1.1.3 从基因组文库中筛选目的基因
筛选一般选用：菌落（噬菌斑）原位杂交法。
基因组文库克隆--转膜，DNA变性--探针杂交--显示阳性克隆--挑阳性克隆--阳性克隆扩增。
4.1.1.4 基因组文库的应用
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