Illumina输出文件详解

Illumina测序原理（next-seq-550）

基本过程

Illumina测序包裹文库制备、簇生成、测序、数据分析四个过程。

• 文库制备：主要是制作一些碎片化的核酸序列，并将这些碎片化的序列和接头序列连接起来。接头序列包括一段与测序芯片上的寡聚核苷酸（oligo）反向互补的一小段序列，同时如果需要也可以通过PCR插入一段index序列用于标记序列所属的样本。
• 簇生成：该过程主要是桥式PCR的过程。在芯片上有两种寡聚核苷酸，首先被测序的单链DNA的接头与其中一种寡聚核苷酸识别互补，随后以被测序的单链DNA作为模板合成反向互补的DNA序列。合成完毕以后，进行核酸变性，洗去被测序的单链DNA。而后，被合成的DNA序列由于在3‘段的接头序列中存在与第二种寡聚核苷酸的互补序列，因此可以与第二种寡聚核苷酸序列识别。识别以后，会根据模板连生成一段反向互补序列。重复上述过程，完成簇生成。最后会切去第二种寡聚核苷酸延伸出的单链DNA。
• 测序的过程即加入引物进行测序，核苷酸可以通过合成发出的荧光确定。具体原理参考illumina手册。双端测序则会在该过程结束后重新进行桥式PCR并切去第一种寡聚核苷酸延伸的单链DNA，并重新执行测序过程。
• 数据分析过程，使用illumina专用的Sequencing Analysis Viewer分析生成BCL、图像等原始文件，再通过bcl2fastq即可获得fastq序列并继续后续分析。

基本概念

• 流动槽（flow Cell）：该名称为Illumina的官方术语，也称作芯片，为一次性用品。其表面遍布寡聚核苷酸。
• 泳道（lane）：一个流动槽有4个泳道。泳道指带有专用输入输出端口的物理通道。
• 表面（surface）：流动槽会在顶面和底面两个表面成像。一个小区的顶面成像后，该小区的底面会接着成像，之后会移至下一个小区。
• 每泳道测绘带数（swaths per lane）：测绘带是泳道中的一列小区。
• 相机片段（camera segments）：仪器使用6个相机对流动槽成像，为每个泳道成像3个片段。
• 每个相机片段的的每测绘带小区数（tiles per swath per camera segment）：小区是流动槽上的区域，相机将其视为一个图像。
• 小区（tile）：小区是流动槽上以相机的视野定义的小成像区域。

流动槽组件	高输出	中等输出
泳道	4	4
表面	2	2
每泳道测绘带数	3	1
相机片段	3	3
每个相机片段的每测绘带小区数	12	12
成像小区总计	864（相乘）	288（相乘）

注：泳道1和3（泳道对A）同时成像。泳道2和4（泳道对B）再泳道对A完成后成像。

注：相机编号为1-6。相机1-3对泳道1成像。相机4-6对泳道3成像。对泳道1和3成像后，成像模块会沿x轴方向移动，以便对泳道2和4成像。

BCL文件（Base Call Files）

BCL文件是由Illumina测序仪生成的测序文件，包含测序的信息。包括簇数和碱基信息。

• 簇数：无符号32位整数（unsigned int, 4 Byte）表示。由开头的4个字节存储。
• 碱基信息：无符号8位整数（unsigned char, 1Byte）表示。低位0-1比特位（bit）表示碱基（00-A，01-C，10-G，11-T），2-7比特表示碱基的质量分数，向右移2位即表示为该碱基的质量分数。

注：整数在内存中表示时从高地址向低地址表示。18 18 AA 08（16进制）实际表示为08 AA 18 18，即需要倒序为真实整数。

注：bit位由左向右为7-0。

例：

地址	数据（Hex dump）	值
0x00000000-0x00000003	18 18 AA 08	145365016（08AA1818，簇数）
0x00000004	81（1000 0001）	01 -> C，1000 00 -> 32
0x00000005	80（1000 0000）	00 -> A，1000 00 -> 32
0x0000000C	55（0101 0101）	01 -> C，0101 01 -> 21
0x0000000F	3B（0011 1011）	11 -> T，0011 10 -> 14
……	……	……

BCI文件（Base Call Index Files）

本文件与bcl.bgzf.bci文件不同。本文件主要表征的是每个泳道中的每个小室中簇的数量，每个簇即对应一条Read。每条记录由两个无符号32位整数表示。其中低32位标识tile的编号，高32位标识小室中的簇的数量。

例：

地址	数据（Hex dump）	值
0x00000000-0x00000007	5D 2B 00 00 / 35 EE 09 00	11101（小室编号）/ 650805（簇数量）
0x00000008-0x0000000F	5E 2B 00 00 / D8 DF 09 00	11102 / 647128
0x00000010-0x00000017	5F 2B 00 00 / 00 BE 09 00	11103 / 638464
0x000006B8-0x000006BF	10 5B 00 00 / 60 3A 0A 00	23312 / 670304
……	……	……

小室编号规则：

• 表面：1表示顶面，2表示底面
• 测绘带：1、2或3
• 相机：1、2、3、4、5或6
• 小区：01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、11、12
• 如：小区编号12508表示顶面、测绘带2、相机5和小区8

BGZF文件（Block GNU ZIP File）

该文件是BCL文件的压缩文件，压缩格式为BGZF格式，该格式与gzip格式兼容，可以使用gunzip命令或者7z解压。该文件实际上由按照序列排列的GNU ZIP压缩块组成，每个压缩块均可表示一个独立的gzip文件。即将gzip文件拼接成1个文件即是bgzf文件，拥有快速随机读写的能力。每个gzip压缩前后均不超过64KB。

• 每一个gzip块的开头序列为：1F 8B 08 04 00 00 00 00 00 FF 06 00 42 43 02 00；
• 每一个gzip块的结束序列为：1f 8b 08 04 00 00 00 00 00 ff 06 00 42 43 02 00 1b 00 03 00 00 00 00 00 00 00 00 00；

开头信息为：

主要：

Field	Description	Type	Value
ID1	gzip IDentifier1	uint8_t	31
ID2	gzip IDentifier2	uint8_t	139
CM	gzip Compression Method	uint8_t	8
FLG	gzip FLaGs	uint8_t	4
MTIME	gzip Modification TIME	uint32_t
XFL	gzip eXtra FLags	uint8_t
OS	gzip Operating System	uint*_t
XLEN	gzip eXtra LENgth	uint16_t

附加1：

Field	Description	Type	Value
SI1	Subfield Identifier1	uint8_t	66
SI2	Subfield Identifier2	uint8_t	67
SLEN	Subfield LENgth	uint16_t	2
BSIZE	total Block SIZE minus 1	uint16_t

附加2：

Field	Description	Type	Value
CDATA	Compressed DATA by zlib::deflate()	uint8_t[BSIZE-XLEN-19]
CRC32	CRC-32	uint32_t
ISIZE	Input SIZE (length of uncompressed data)	uint32_t

本文件的任意压缩块均包含上面的全部内容。

BGZF.BCI（Block Compress Index，可能叫这个名字）

需要注意的是这个文件与bci（Base Call Index Files）文件是不同的，本文件为BGZF压缩文件的索引文件。但本文件与bci（Base Call Index Files）文件是存在对应关系的。与bci文件相同的是，本文件的总记录数量与bci（Base Call Index Files）文件的记录数量是相同的，每一条记录均表示为一个小室（Tile）。由头信息与记录组成。

需要值得注意且极其重要的是，每一条记录都对应的都是一个小室，且每个小室都由不止一个gz块组成。每条记录的低16位与高48位组成，高48位即本小室开始的gz块在整个bgzf文件中地址。低16位表示该gz块解压后的数据块中本小室开始的地址。

如：04 00 / 00 00 00 00 00 00，表示第一小室（如泳道1的编号11101小室）的起始gz块的地址在整个bgzf文件中为0x00 00 00 00 00 00，04表示本小室在第一块gz块解压后的地址0x04开始。

如：39 EE / B2 E3 02 00 00 00为第二条记录，表示第二个小室的起始gz块的地址在整个bgzf文件中为0x00 00 00 02 E3 B2，39 EE表示第二小室在这个gz块解压后的数据的地址0xEE 39开始。

例：

地址	数据（Hex dump）	值
0x00000000-0x00000003	00 00 00 00	0（头信息）
0x00000004-0x00000007	D8 00 00 00	216 （头信息，小室数量）
0x00000008-0x0000000F	04 00 / 00 00 00 00 00 00	4 / 0（记录）
0x00000010-0x00000017	39 EE / B2 E3 02 00 00 00	60985 / 189362
……	……	……

FILTER文件（簇过滤信息文件）

本文件主要包含的是每个簇的是否被过滤的信息。其中0-12 Byte表示该文件的头信息，包括头、版本、簇数。后面信息则为记录，每条记录为1 Byte。

例：

地址	数据（Hex dump）	值
0x00000000-0x00000003	00 00 00 00	0（头信息）
0x00000004-0x00000007	03 00 00 00	3（文件版本号）
0x00000008-0x0000000B	18 18 AA 08	145365016（08AA1818，簇数）
0x0000000C	00	False 未通过过滤，在Fastq的头中用Y表示
0x00000130	01	True 通过过滤，在Fastq的头中用N表示
……	……	……

LOCS文件 （簇位置信息文件）

本文件主要记录的是每个簇所在的位置信息。其中0-12 Byte表示该文件的头信息。后面每8 Byte为一条记录，每条记录包括x轴位置信息和y轴位置信息。

例：

地址	数据（Hex dump）	值
0x00000000-0x00000003	01 00 00 00	1 (Uint32) 头信息
0x00000004-0x00000007	00 00 80 3F	1.0（Float32）头信息
0x00000008-0x0000000B	EF E1 2F 02	36692463（022FE1EF，簇数）
0x0000000C-0x00000013	32 92 5B 43/21 EC 03 40	219.57（Float32，x轴坐标）/ 2.06 (Float32, y轴坐标)

坐标信息转换到Fastq文件中时需要进行一定的转换，具体转换公式如下：

_pos = (Uint32)record_pos*10+1000.5

Fastq格式文件 （Illumina）

Field	Description
@	每一条记录的开始
instrument	设备号
run ID	系统运行编号
flow cell ID	流动槽编号
lane	泳道编号
tile	小区编号
x_pos	x轴坐标
y_pos	y轴坐标
UMI	[Optional] The UMI sequence (A, G, C, T, and N). When the sample sheet specifies UMIs, a plus sign separates the Read 1 and Read 2 sequences.[后接一个空格]
read	1/2分别表示单端或双端中序列1或序列2，单端测序仅有1，双端存在1和2
is filtered	Y-表示被过滤，N-表示未被过滤
control number	0—Control bits are not turned on.*
index sequence or sample number	[可选]接头序列或者样本的编号

第二行为碱基序列；

第三行为注释，一般为+；

第四行为质量信息，为phred33格式表示。