样本的采集方法往往影响着后续的实验结果。微基生物搜集了多篇文献,将人体牙菌斑、唾液、痰液、舌苔的微生物的采集方法进行了汇总。下述采集方法仅供参考,具体实验的采集方法,还需根据实验进行具体设定。
根据实验的目的,确定选择受试者的条件,如考虑年龄、身体健康、牙齿数量、牙齿健康状况、有无特殊疾病等因素。根据考虑的因素,选择符合条件的受试者。向受试者交代实验的目的、过程、风险、收益及退出机制等,确保受试者理解全部实验内容,待受试者签订知情同意书后开始取样。
1 样本的采集
1.1 牙菌斑
受试者无其他口腔疾病,无家族遗传疾病,无系统性疾病,无长期服药史, 近3个月内未服用抗生素服及免疫抑制剂。
取样前天晚上不要刷牙,第二天早上在未进食前取样。首先用无菌生理盐水冲洗收集区,棉卷隔湿,之后根据实验目的,用采集拭子分别采集牙齿的舌面、 唇面、龋齿损伤区等部位的牙菌斑。采集时,建议由同一操作者进行牙菌斑的采 集操作。采集时在采集部位来回刮擦 3-4 次,之后翻转采集拭子,在同一部位继续进行刮擦 3-4 次,每个样本均采用一个采集拭子进行采集。采集完成后,将带有牙菌斑的采集拭子置于含有 1ml TE 溶液的无菌保存管中,掰断采集拭子后, 对保存管进行封口。置于冰上,待样本采集完后,尽快转移至实验室,放入-80℃ 冰箱进行保存。
若无法实现低温保存,可以采用微基生物研发的口腔微生物 DNA 常温保存液,可以实现口腔微生物样本的DNA检测常温保存和运输。
1.2 唾液
建议采集早上、未进食的受试者的唾液,若受试者吃过饭,则需在饭后2小时后再进行采样。采集前,先让受试者用 20mL 生理盐水漱口 1min,之后自然口含唾液数分钟后,由同一名操作者将灭菌 EP 管置于受检者下唇口腔黏膜,使唾液自然流入,采集非刺激性唾液样本 3ml,冷藏,放入-80℃冰箱进行保存。
若无法实现低温保存,可以采用微基生物研发的唾液微生物 DNA 常温保存液,可以实现唾液微生物样本的DNA检测常温保存和运输。
1.3 痰液
1.3.1 能自行留痰者
建议采集早上受试者的痰液,以清晨第一口痰为宜。早上受试者刷牙后,用清水反复漱口 3 次,之后采用拍背或刺激咳嗽,让受试者深呼吸数次后用力咳出气管深处的痰液,将痰液放入无菌的 EP 管中,盖好瓶盖。对于痰液少或者无痰的受试者,可采用雾化吸入加温至45℃的 10% NaCl 水溶液,可使痰液易于排出。 对于痰液较少的幼儿,可轻轻压迫胸骨上部的器官,使其咳嗽,将痰液排出。注意痰液中不可混入漱口液、唾液、鼻涕等。若受试者为其他时间采集,则需多次漱口,除去口腔中的食物残渣等杂物。每个受试者,需采集 1 口痰。
1.3.2 人工辅助呼吸者
对于无法咳痰等受试者可采用吸痰法收集痰液。由同一名操作者对受试者进行痰液收集。操作者戴无菌手套,将痰液收集器连接在负压吸引器上,打开吸引器开关,将导管插入咽喉深部,留取痰液标本 5-10ml 后加盖。采集好的样本需尽快送至实验室,放入-80℃冰箱进行保存。若需采集多个样本,需将采集好的样本先放入事先准备好的冰盒(泡沫盒+冰袋)中进行保存,之后一起带回实验室。
1.4 舌苔
舌苔的采集,可以用压舌板刮取的方式,也可以用采集拭子刮取进行采集, 但压舌板刮取舌苔后,转移到保存管中较为麻烦。微基生物对压舌板刮取和拭子 刮取的微生物做过对比,两者采集方式采集的微生物结构组成,并未有明显差异。 推荐拭子刮取舌苔微生物的方式。
采样面积一般为 2cmX2cm 面积,但具体取样区域,取决于具体的实验项目设计。手持无菌采集拭子,在采样的目标区域,从上到下,从左至右,顺序刮取几次,每刮一次,请将拭子旋转 90 度,使拭子每一面都充分刮取到样本。采样结束后,将采集拭子头掰断(头部处有特意设计的缺刻处,方便掰断),放入无菌的螺口管中,旋紧螺口盖,放入-20℃或-80℃进行保存。
若无低温保存条件,可以采用微基生物研发的口腔微生物 DNA 常温保存耗材,包括 1ml 常温保存液和 2ml 保存管。将采集好样本的拭子头,掰断后没入保存液中。旋紧螺口盖,摇晃震荡保存管数次,使拭子头收集的微生物与保存液充分结合。可以直接冻存于-20℃或-80℃温度(可保存数月),或室温下直接寄送到实验室(保存液中的拭子头,室温可保存 7 天)。
2 样本的保存和寄送
将样本放入-80℃冰箱进行低温保存,若条件不允许,可短期(1 个月内)在-20℃冰箱中冷冻保存。注意在样本冻存期间,请勿反复冻融。 送样时请尽量使用冰盒(泡沫盒+干冰+冰袋),以保证运输过程中的低温条件(干冰的挥发消耗量约为 3 公斤/天)。在打包时先放入足量的干冰,之后用冰袋填充泡沫盒中间的空隙,为了保持冰盒中的低温环境,建议采用厚一点的泡沫盒。
若采用微基生物研发的口腔、唾液等样本的微生物 DNA 常温保存耗材,则无需用干冰,可直接快递含有样本的保存管即可。