零基础小白笔记6 | 使用bowtie2进行数据比对

  ❀前言：（书接上回）

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零基础小白笔记2 | 数据与样本信息处理

零基础小白笔记3 | 数据处理与质控

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零基础小白笔记5 | 数据清洗与再次质控

一、下载bowtie2：

conda install bowtie2
## 或者使用pip命令
pip install bowtie2

二、下载参考基因组：

【注意，本数据的实验模型是小鼠，故参考基因组为mm10数据，下载地址】

（1）进行数据下载：

wget http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/chromFa.tar.gz 

（2）数据下载完成后解压：

tar -zxvf chromFa.tar.gz 

 （2.1）tar命令的使用：代码中表示使用gzip进行解压缩，并显示详细信息，指定归档文件名称；

•  -c: 创建新的归档文件；
• -x: 解压归档文件 ；
• -f: 指定归档文件的名称 ；
• -v: 显示详细信息 ；
• -z: 使用gzip压缩/解压缩 ；
• -C: 切换到指定目录；

（3）合并文件：

cat *.fa > mm10.fa

（3.1）该命令用于合并多个fasta格式的文件，将所有以.fa结尾的文件内容合并成名为mm10.fa

（3.2）其中，*为通配符，>表示将输出重定向到一个文件中；

三、构建索引

bowtie2-build mm10.fa mm10

（1）bowtie2-build 命令用于构建索引，命令格式：bowtie2-build <参考基因组> <索引文件前缀>

（2）该命令中，mm10.fa为参考基因文件，mm10是索引文件前缀；

四、运行bowtie2 获取 SAM 文件

（1）分析单端测序的数据：

bowtie2 -p 6 --local -x mm10 -U ./data/cleandata/SRR5195455.fastq -S SRR5195455.sam

• -p ：分析数据时所用的线程数；命令中表示用6个线程分析；

• --local：使用Local的对比模式；

• -x：指定比对所使用的索引文件前缀；本次分析中索引文件前缀为mm10；

• -U：指定单端测序数据文件；

• -S：指定对比结果输出文件；本次分析中将输出文件设为SRR5195455.sam；

（2）分析双端测序的文件：

bowtie2 -p 6 -x mm10 -1 input_1.fq -2 input_2.fq 

• -1：指定双端测序数据文件的第一条读取序列文件；

• -2：指定双端测序数据文件的第二条读取序列文件；

• 其余选项意义相同；

（3）sam文件：是一种用于存储测序数据的比对结果的常用的文本格式，通常包含了测序数据中每个读取序列的比对位置、比对质量、序列标识等信息；SAM 文件是一种文本文件，可以使用文本编辑器进行查看和编辑；

（4）SAM 文件通常会被进一步转换为 BAM（Binary Alignment/Map）格式，以便于存储和处理。BAM 格式是 SAM 格式的二进制版本，可以更加高效地存储和处理大规模的比对结果数据；

五、sam文件转换为bam文件：

samtools view -hb SRR5195455.sam > SRR5195455.bam

（1）samtools工具是一个用于处理sam和bam格式文件的工具集，可以对测序数据进行处理、分析和转换，如格式转换、排序和索引、对比文件处理、统计信息和比对操作等；

（2）samtools view命令用于将bam文件转换为sam文件；用法：samtools view   [options]   <file>

• -b: 将sam文件转换为bam文件输出；
• -h: 输出文件包含头部信息；
• -q <int>: 仅输出比对质量大于等于指定值的比对记录；
• -L <file>: 仅输出与指定bed文件中区域重叠的比对记录；
• -r <readgroup>: 仅输出与指定read group匹配的比对记录；
• --no-unal：删除没有被比对的查询序列；如果未指定该选项，Bowtie2将输出两个文件，一个是经比对的序列文件，另一个是未被比对的查询序列文件；

六、bam文件的排序：

（1）排序后的BAM文件按照染色体的编号和起始位置进行排序，可以方便的进行基因组序列的比对分析、注释等操作；samtools sort命令根据SAM、BAM或CRAM文件中的坐标对比对进行排序

samtools sort -O BAM -m 8g -@ 6 -o ./SRR5195455_sorted.bam SRR5195455.bam

（2）用法：samtools sort -o output.bam input.bam

• -O：代表输出文件格式为BAM；
• -m：指定每个线程的最大内存；允许使用后缀K/M/G（默认值为768M）；
• -@：指定使用的线程数，本次分析使用6个线程；
• -o：指定了排序后的BAM文件的输出文件名；
• input.bam：代表要排序的输入BAM文件；

七、查看bam文件：

samtools view -h SRR5195455_sorted.bam | less -S

• -h ：代表查看bam文件时保留头部信息；
• |：为管道符，将左侧命令的输出结果输入到右侧命令；
• less命令可用于查看文件
• -S：代表查看文件时在水平方向上不换行；

八、计算mapping率：

bowtie2 flagstat your_alignment_file.bam

1.bowtie2 flagstat命令可以用于统计比对情况，包括比对的reads数目、未比对的reads数目等。