理解高通量测序技术和单细胞测序技术（自用）

首先明确单细胞测序技术不一定是高通量的，有单细胞测序技术，高通量测序技术，包括高通量测序技术在内的所有高通量技术，用于单细胞测序的高通量技术。

如果我们要从技术层面理解单细胞测序并分析其优势，就必然绕不开对“单细胞测序”“高通量技术”等概念的准确的把握。我们必须搞清楚，当一种技术前面带了“单细胞”（Single-cell）或“高通量”（High-throughput）的字眼时，它们分别代表了什么。

单细胞，就是单个（仅一个）细胞的意思。针对单个细胞展开的分析统称为单细胞分析（Single-cell analysis），针对单个细胞进行的测序就是单细胞测序（Single-cell sequencing），如果是对多个细胞或者一群细胞的测序，就不是单细胞测序。比如面向大众的那种测着玩儿的基因测序，一般是取待测者的血液，做简单的处理后就直接提取某些DNA片段。至于提取到的是这一个白细胞里的，还是那个白细胞的，又或是血液中的游离DNA，就无从而知了。又比如一般的肿瘤研究，通常是对肿瘤组织分离出来的为数不少的肿瘤细胞测序。单细胞测序是一种特殊的测序；目前，大部分的测序都不是单细胞层面上的测序。

高通量又是什么意思呢？通量，你可以理解为一次实验时独立的、平行的反应的数目。这些反应是在不同的容器或反应器里的，彼此独立，互不干扰；但又是在相同的环境里同时（或几乎同时）进行的，所以说是平行的。假设我们对细胞进行分析，下图中的试剂与细胞中的某种成分进行反应。

（为了方便，只画了28个平行反应，实际上在高通量技术领域，28的通量实在不算高。）
高通量技术存在的意义，我认为主要在于它有效地节省了某个实验对人力物力财力的耗费。另外，同样的反应同时展开三个以上，可以消除随机性对反应结果的影响，从而得到较为严谨的反应结果。

比较原始的实现高通量的方式，是实验室苦力们用双手操作移液枪，在96孔板或384孔板里加各种试剂。但手动操作的局限性很大，速度也很有限。很有可能加到第100个反应的时候，第100个反应刚开始，第1个反应已经结束了。这样，这两个反应还能称得上是平行的吗？手动操作达不到很高的通量，于是高通量技术逐渐地向机械化、自动化的方向发展。市面上也早已有不少的液体操作机器人或点样仪。它们就具备这样的能力。

右图是96孔板，有这种底的，也有圆柱体、平底的。

高通量技术是一种具有普适性的、应用范围（可以）很广的技术。理想状况下，未来很多的实验，尤其是生命科学领域那种涉及大量的加液、加液、加液的重复性操作的实验都应该往高通量的方向发展，这样可以解放科研工作者的双手，让他们把精力留给思考，和真正的科研。就先不提测序，举个例子，高通量筛选（High-throughput screening，HTS）。

高通量筛选技术在药物筛选领域有着不可忽视的应用价值。要知道，一种药物从合成到真正应用到临床的周期有多么漫长。在应用到人体之前，药物不仅要经过分子层面的表征，还需要通过细胞实验和动物实验。细胞实验时，不仅要对药的效果进行验证，对药物本身进行筛选，还需要在众多条件中筛选出最佳的给药条件。这个过程非常地laborious，也非常地昂贵。高通量筛选技术可以缩短筛选所需的时间，提高筛选效率。比如要从含有300种分子的文库（library）中筛选出真正有效的药物。如果高通量技术能同时进行900个平行反应（每种分子对应3个反应），那么，筛选就可以一次完成。

高通量测序（High-throughput sequencing） 二代测序（Next-generation
sequencing）是目前最常用的测序技术，像Illumina的那些测序仪的测序原理就属于二代测序的范畴。二代测序是在人类基因组计划（Human
genome project，HGP）的背景下发展起来的，是大规模平行的（Massively parallel），寄托了人们对 $1,000
genome（把一个人类个体的全基因组测序费用降低到1000美元）的期望。二代测序基本上等同于高通量测序，其最大的意义与其他高通量技术的意义相统一，就是大幅度降低成本，提高效率。
不同的二代测序技术实现高通量的方式有所不同。比如，454测序技术[1]（后被罗氏收购，现已淘汰）把DNA碎片化，得到DNA片段（DNA
fragments）并使之变为单链之后，用磁珠捕获这些DNA片段，确保one fragment per
bead。然后将这些磁珠包裹到含有PCR试剂的液滴中，进行PCR反应，以扩增磁珠上的DNA片段。由于液滴是由油相间隔开的，互不干扰，因此液滴相当于是微反应器（容纳PCR反应的微型容器），而这样的基于液滴的PCR反应是高通量的（不同液滴中的PCR反应是独立、平行的反应）。液滴中扩增的DNA片段也被捕获在磁珠上。之后，该测序方法会使液滴破裂，收集所有的磁珠，并将磁珠分散到不同的微坑之中，对这些磁珠进行同时的、高通量的测序。

而目前最常用的Illumina测序仪所采用的Solexa测序技术与之不同，不需要用到磁珠，过程相对简单。它会事先地在芯片内通道的底部修饰两种被称作接头（Adapter）的寡核苷酸，其分别与DNA片段两端接上的两段核苷酸互补。然后进行桥式PCR，在这种扩增方式中，以待测DNA片段为模板合成的DNA链由于离通道底部较远的一端与附近的接头互补，会向该接头弯曲，并形成“一座桥”（桥式扩增以此得名），然后DNA聚合酶以这座桥为模板形成新的链。这样的过程不断重复，最后成簇。由于桥式扩增里，某一条DNA链只能和最近的接头形成“桥”，所以这些以同一条DNA链为模板合成的DNA链只会局限在局部，形成密密的一小撮，所以说是“成簇”。不同的待测DNA链在不同的位置形成不同的簇（Cluster），起到了聚集并放大信号的作用。

Illumina测序的桥式扩增

单细胞测序（Single-cell sequencing）
由于高通量测序是目前最常用的测序技术，单细胞测序用的测序技术自然也以高通量测序技术为主。然而，单细胞测序并不在高通量测序技术及其测序仪上做文章，它的难点以及和普通测序的不同之处主要在于测序前的前处理，包括单细胞的捕获，目标DNA/RNA的提取，微弱信号的放大（即极少量DNA链的扩增）等等。
难点1：单细胞捕获。如何将细胞分散到独立的容器或反应器中去，让它们彼此独立，互不干扰？
难点2：目标DNA/RNA的提取。提取不是问题。问题在于，提取时怎样让待测DNA或RNA带上不同的标记，以便测序完了以后还能分辨出来哪些序列是属于同一个细胞的？
难点3：信号放大。实际测序时，裂解一群细胞所得到的待测DNA含量都是很低的。目前的测序都含有PCR扩增这一步，而且这一步显得相当重要。更何况是一个细胞？一个细胞中的DNA或RNA简直太少了，稍一操作就可能丢失。怎么样能尽量地减少样品损失和扩增时发生的偏移和错误呢？

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我个人的研究方向是微流控（Microfluidics）。微流控技术具有精确操控微量液体的能力，是一种适合应用于单细胞分析领域、而且已经在这方面体现了自身价值的技术。就在这个问题提出之后，没过多少天，2015年5月21日，同一期Cell上发表了两篇相似的、利用微流控技术来实现单细胞捕获的文章[2,3]。它们均采用了微流控领域中经典的十字形通道构型。如Drop-seq（下图左），在主通道内引入了含有磁珠和逆转录所需试剂的溶液，与之垂直的第一组侧通道引入了细胞悬液，第二组侧通道则引入了与溶液不相溶的油相（如矿物油）。油相对水相的切割作用使溶液被“夹断”，从而形成球形的液滴。液滴对磁珠和细胞的包裹基于泊松分布的原理，也就是说，磁珠和细胞是随机地被包裹在液滴中的，但我们可以根据泊松分布，通过稀释磁珠悬液和细胞悬液的密度，以尽可能降低液滴包裹两个（或多个）细胞或两个（或多个）磁珠的概率，并达到较高的单磁珠单细胞的捕获概率。虽然这种捕获方式无法达到很高的捕获概率，但鉴于液滴生成的速度非常快（大于100,000/min），因此实现了非常高的通量。

液滴的角色是微反应器，你可以把这些不可计数的体积很小（纳升级）的液滴想象成是一种球形的、柔软的容器。只不过间隔这些容器的不是离心管壁，不是塑料，而是与液滴不相容的油。但这种“容器”毕竟没有那么稳定；而且向这些已经形成的液滴中加入其余新的试剂，那是一件非常难的事情。因此这里借助了磁珠的作用。磁珠上修饰了引物，引物上除了含有一段通用的PCR引物，还有一段cell barcode，即细胞标记（用来标记每个细胞的来源,不同的细胞有不同的barcode），同一个磁珠上的引物带有相同的cell barcode，而不同磁珠之间的barcode则是不同的。另外一段UMI（Unique molecular identifier），是用来标记分子的，每一条引物都有它特定的UMI(标记mRNA 用处：PCR扩增之前的重复需要保留，PCR扩增之后的重复需要去除。怎么实现呢？UMI(Unique Molecular Identifier)数字标签技术这时候就派上用场了，只要在PCR扩增之前给每个分子加上一个特有的标签，之后无论经过多少个循环的扩增，这个标签都一直伴随着同步进行复制，最后可以通过UMI的种类对真重复和假重复进行区分，从而达到去除扩增重复的目的)。
当一个磁珠和一个细胞被包裹于一个液滴微反应器中，液滴中含有的细胞破膜剂使细胞破裂，释放其内容物，磁珠即捕获了该细胞的某些RNA。之后就只需取出这些磁珠，对这些磁珠进行逆转录、PCR扩增、测序等过程。由于每条分子都已经含有UMI和cell barcode，这些操作都可以用常规的方式，在离心管中统一进行。

这两篇是单细胞RNA测序，而单细胞DNA测序面临更严重的样品太少、容易损失的问题。单细胞DNA测序对于扩增方法的均匀性和准确性有更高的要求，在这方面微流控技术也发挥了它的作用。比如2015年9月发表在PNAS上的一篇文章[4]，先是用显微操作取了一个细胞到小离心管里，使细胞裂解。然后也用十字形微流控通道使单细胞裂解产物生成液滴，并尽量保证每个液滴中含有0或1条DNA分子。将DNA分子分散到独立的液滴微反应器之后再进行的扩增反应具有更好的均匀性，更有利于单细胞全基因组测序。

以上是背景。现在我再来正面回答一下这个问题。
单细胞测序具有诸多的难点，涉及到一系列不同的技术，它更多地是代表了一种研究方向。我们只有在讨论某一项具体的技术或产品时才会去比较它的优势和劣势。
对于单细胞测序，我们似乎更应该着眼于它的“研究意义”和“研究价值”。单细胞测序那么难做，为什么还要去做它呢？实际上，包括单细胞测序在内的单细胞分析的意义，现在还存有争议。我就认识一位老师，他不太认同单细胞分析的意义，觉得没必要对单个细胞进行如此深入的分析。但随着单细胞相关的研究越来越普遍，越来越深入，应该会有越来越多的人认可它的意义。

单细胞测序的意义的根本在于细胞的异质性（Heterogeneity）。就是说，细胞与细胞之间存在个体差异性，即便是出于同一位置的细胞，也可能在基因表达等方面存在一些差异。对细胞群体的研究，只能得到这群细胞平均化的结果。而这结果是掩盖了细胞异质性的。两个具体的例子。
一是细胞分类。那篇Drop-seq的切入点就是细胞分类系统。以往我们在对细胞进行分类时，往往依据的是细胞的空间位置、形态等特性，这种分类方式相当地简单粗暴。进行单细胞水平的RNA测序或DNA测序，有助于实现更为细致和严谨的细胞分类，尤其是对于比较复杂的组织，单细胞测序能促进人们更深入地了解细胞与细胞的功能。
二是肿瘤相关的研究。现在一个认可度比较高的关于肿瘤转移的假说是，肿瘤上某些细胞会从原位脱落，进入血液循环，成为循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）。有些CTCs可能会顺着血液流到某个器官，侵入血管，侵袭该器官，附着，增殖，长出新的肿瘤。那么，原来那颗肿瘤里哪些细胞会成为CTCs，而CTCs中哪些可以在血液循环中存活下来，并且完成肿瘤转移呢？这些具备超乎寻常的能力的CTCs和寻常的CTCs之间有什么区别？这就需要单细胞层面上的测序和其他相关研究了。
目前，单细胞测序或其他的单细胞研究看似是不太“实用”的研究方向。但它代表着人们已经注意到了细胞的异质性，开始关注细胞个体而非群体，代表了一种更深入的视角，一种更精准地理解生命的可能性。仅从这个方向来想，其实，我就觉得它够有意义的了。

参考文献：
[1] M. Margulies, et al., Genome sequencing in microfabricated
high-density picolitre reactors, Nature 437 (2005) 376–380. [2] Macosko, E.Z., et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. CELL, 2015.161(5): p. 1202-1214.
[3] Klein, A.M., et al., Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. CELL,
2015. 161(5): p. 1187-1201.
[4] Fu, Y., et al., Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genome amplification.
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES
OF AMERICA, 2015. 112(38): p. 11923-11928.编辑于 2019-08-12

作者：董阿橘 链接：https://www.zhihu.com/question/30307493/answer/784368455
来源：知乎