vegan稀释曲线 基因丰度_蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌物种多样性

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)隶属豆科沙冬青属, 是西北荒漠生境中唯一常绿阔叶灌木, 耐干旱、抗逆性强, 在保持水土和防治荒漠化方面作用显著[。与蒙古沙冬青相伴而生的霸王(Zygophyllum xanthoxylum)、四合木(Tetraena mongolica)、白刺(Nitraria tangutorum)、沙蒿(Artemisia desterorum)等, 同蒙古沙冬青既存在竞争抑制, 又协同进化, 均为优良固沙植物[。

荒漠生境中植物与微生物的生长、分布及其相互作用对生态系统改善和稳定有重要影响。AM(arbuscular mycorrhiza)真菌是一类在自然界广泛分布的土壤真菌, 能与绝大多数高等植物根系形成互利共生体, 通过根外菌丝形成的网络增强植物根系对土壤养分资源的吸收利用, 提高植物生产力[。研究发现, AM真菌能够提高植物在干旱、重金属污染、病虫害等逆境下的抗性[。因此, 探明AM真菌群落组成和生物多样性以及与荒漠植物共生机理, 对促进植物适应极端干旱环境, 稳定和改善荒漠生态系统有重要意义。

迄今为止, 荒漠环境中共发现9属107种AM真菌, 并不断有新种报道和已知种类分类地位的重新认识[。目前, 主要依据孢子形态特征进行AM真菌分类鉴定, 研究结果存在偶然性、局限性和不一致性[。由于广域的地理环境和生态差异, 不仅导致AM真菌种群强烈分化, 也导致了种间和种内的形态多态性与环境饰变作用下的性状变异难以区分, 要解决这一问题, 对AM真菌分子特征、微形态特征等方面的工作将会起到重要作用。Luke等[利用T-RFLP技术分析表明, 种植模式对土壤AM真菌多样性有明显影响。Öpik等

本试验在前期基于形态学特征对蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌分类鉴定的基础上[, 利用高通量测序技术进一步分析检测土壤AM真菌种属结构和生态分布, 发掘新的物种和信息, 补充完善AM真菌群落组成和物种多样性, 为阐明蒙古沙冬青适应极端荒漠环境机理, 利用AM真菌资源促进荒漠植物生长和植被恢复提供依据。

1 材料与方法

1.1 样地概况及样品处理

2015年7月于内蒙古乌海、磴口各选取以蒙古沙冬青为建群种的3个样地, 每个样地随机选取长势相似的蒙古沙冬青和两种伴生植物各4株, 其中乌海样地伴生植物为霸王(Zygophyllum xanthoxylum)、四合木(Tetraena mongolica), 磴口样地为沙蒿(Artemisia desterorum)、白刺(Nitraria tangutorum)。去除土壤表面枯枝落叶层, 在距植株主干0—30 cm范围内挖取土壤剖面, 分别采集0—20 cm和20—40 cm土层新鲜土壤各500 g, 将同一样地4株植物按土层混合均匀, 3个样地作为重复, 共计36个土壤样品, 分别标记为SWL (沙冬青乌海0—20 cm), SWD (沙冬青乌海20—40 cm), BWL (霸王乌海0—20 cm), BWD (霸王乌海20—40 cm), HWL (四合木乌海0—20 cm), HWD (四合木乌海20—40 cm), SDL (沙冬青磴口0—20 cm), SDD (沙冬青磴口20—40 cm), BDL (白刺磴口0—20 cm), BDD (白刺磴口20—40 cm), HDL (沙蒿磴口0—20 cm), HDD (沙蒿磴口20—40 cm), 将土样编号装入自封袋运回实验室后, 用于土壤总DNA提取的土样在-20℃保存, 其余土样自然风干后过2 mm筛, 用于土壤理化性质测定。样地具体情况见

表 1 内蒙古荒漠带各采样点概况

Table1 Sampling sites in Inner Mongolia desert zone

样地

Sample site

经纬度

Longitude/Latitude

海拔

Elevation/m

乌海

Site1

39°83′ N106°83′E

1129.45 m

Site2

39°73′N 106°87′E

1109.85 m

Site3

39°73′ N106°81′E

1141.35 m

磴口

Site1

40°39′ N106°74′E

1002.99 m

Site2

40°47′N 106°43′E

1006.47 m

Site3

40°48′N 106°38′E

1002.18 m

1.2 土壤理化性质测定

土壤有机碳用马弗炉烘干法；土壤pH用电位法；土壤速效P用钼锑抗比色法；碱解N采用碱解法利用全自动化学分析仪Smartchem200测定；酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)用改进的Brimner和Tabatabai方法[测定。球囊霉素分易提取球囊霉素(Easy-extrated glomalin, EEG)和总球囊霉素(Total extractable glomalin, TEG), 分别按Wright和Vpadhyaya[及Janos等[的方法测定, 称取1.0 g风干土于试管中, 加入柠檬酸钠浸提剂, 通过高压浸提、再提取上清液离心、用考马斯亮蓝显色, 绘制标准曲线, 求出球囊霉素含量。所得数据由Excel 2003统计整理, 利用CANOCO 4.5软件进行RDA分析。

1.3 土壤总DNA提取、PCR扩增及产物回收

采用已修改的Bead-Beating法[提取土壤总DNA, 用TE缓冲液溶解提取的DNA, 置于-20℃冰箱待用。

基于HiSeq测序对基因片段的限制(300 bp以内)以及真实客观反应AM真菌群落结构和丰富多样性的要求, 第一轮扩增以土壤总DNA为扩增模板, 引物为GeoA2 (5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′)和AML2 (5′-GAA CCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3′), 扩增片段为1000 bp左右。以第一轮扩增产物为模板, 使用带Barcode的特异引物NS31 (5′-TTG GAG GGC AAG TCT GGT GCC-3′)和AMDGR (5′-CCC AAC TAT CCC TAT TAA TCA T-3′)进行第二轮PCR, 扩增片段为280—300 bp。根据PCR产物浓度进行等量混样, 利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 切割目的条带, 使用凝胶回收试剂盒回收目标产物。

1.4 构建文库与测序

使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 使用HiSeq2500 P