storm显微镜成像原理_细胞骨架的STORM超分辨成像研究

摘要：

细胞是生命活动的基本单位,通过显微成像观测细胞内部不同物质和成分的空间分布及相互作用,是目前生物学研究的一个重要手段。显微成像具有无损、非接触、高特异性和高灵敏度等优点,但由于光学衍射极限的限制,传统光学显微镜的分辨率只能达到200nm左右。这大大限制了人们对于纳米级别生物分子的构成及其功能的观测和研究。近年来,随着科技的发展科学家们发明了多种突破光学衍射极限的超分辨成像技术,且成像分辨率可达到10-50nm(接近电镜的分辨率)。目前,基于远场光学的超分辨成像技术主要有两大类:一类是利用非线性光学的方法实现超分辨成像,如受激发射损耗(STED)荧光显微技术和饱和结构光照明显微技术(SSIM);另一类是利用单分子定位的方法实现超分辨成像,如光激活定位显微技术(PALM)和随机光学重构显微技术(STORM)。由于超分辨成像技术可被应用在生物科学的各个领域,如观测细胞膜的蛋白分布、微丝、微管、线粒体、核纤层等生物样品,因此超分辨荧光显微技术成为近几年的研究热点之一,且得到了快速的发展。对细胞骨架的研究在生物学上有着重大的意义,但是细胞骨架的直径大小一般约为几十个纳米,用常规的共聚焦显微镜很难观察到,因此本论文提出利用STORM超分辨成像技术研究细胞骨架。在本论文中我们主要进行了实验样品的抗体浓度、孵育条件的优化,包括一抗孵育条件和不同抗体浓度的实验;以及五组不同激发光功率的实验优化。实验结果表明,一抗过夜孵育能让抗体充分标记上微管,从而得到更为连贯的丝状结构,不同抗体浓度孵育对样品成像结果影响不大,表明在测试的抗体浓度下,标记的样品已达到过饱和状态,再作微调对成像效果产生影响不大;激发光功率在20.0mW左右得到的重构结果最佳,表明在激发光功率为20.0mW时,分子单次闪烁产生的总光子数较多且闪烁效果更为理想,从而得到更连续的细胞微管结构。氧气参与细胞内部循环,能产生供给细胞生长、增殖和合成所需的能量。因此氧气是保证细胞得以正常生长的必需气体环境之一。缺氧会导致组织代谢、功能和形态结构发生异常变化,缺氧性细胞损伤主要为细胞膜、线粒体和溶酶体的损伤。很多肿瘤组织微环境处于缺氧状态,缺氧与肿瘤细胞的生理功能关系密切。利用优化后的实验系统,对缺氧处理后的HeLa细胞的微管结构进行标记染色,然后进行STORM超分辨成像,将正常培养的微管超分辨成像图与进行缺氧处理后的微管超分辨成像图进行对比。结果表明,缺氧环境下的HeLa细胞微管结构变得更为交错杂乱且十分密集,这种情况也会出现在细胞分裂期阶段。这与2017年Ji?í?ehulka课题组对肿瘤细胞缺氧进行研究[47]的报道结果一致:细胞由某种未知途径进入到细胞分裂阶段,引起肿瘤细胞的大范围迁移扩散的原因或结果,从而增强其抗药性和耐药性。

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